lisiman实验二血清蛋白的盐析及清球比值测定.ppt

下次实验： 第三篇 生物化学与分子生物学实验 第二十章 基础性实验 实验3 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的 竞争性抑制作用 P123 * 医学生物化学与分子生物学实验教程 第三篇 生物化学与分子生物学实验 第二十一章 综合性实验 实验3 血清蛋白的盐析及清/ 球比值测定 P179 实 验 二 血清蛋白的盐析及清/ 球比值测定 掌握盐析的原理和方法。掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理和方法。了解血清蛋白质定量测定的临床意义。 【实验目的】 （Experimental Objectives） (Experimental Principles) 蛋白质的胶体性质 蛋白质的呈色反应——考马斯亮兰染色法 【实验原理 】 盐析 ：是使蛋白质从溶液中沉淀的一种方法。 （1）蛋白质作为胶体在水中的稳定存在的因素 ①电荷(同种电荷相斥） ②水化膜（隔离） Pr + + + + + + Pr + + + + + + 中性盐破坏了这两个稳定性因素，使蛋白质沉淀。 【实验原理 】 中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 沉淀蛋白质的方法还有哪些？ 【实验原理 】 蛋白质的沉淀：蛋白质从溶液中析出。 沉淀的原因:破坏水化膜;改变蛋白质表面基团的解离。 沉淀的方法:盐析法;有机溶剂法;重金属盐沉淀法;生物碱试剂沉淀法；加热沉淀。 【实验原理 】 正常人的血清总蛋白中清蛋白占绝大部分约60%以上，其余为球蛋白，两者比例为1.5-2.5：1。兔血清清球比0.6-1.5：1。 清蛋白在水中溶解性大于球蛋白，在血清中加入硫酸铵至半饱和时，球蛋白可被完全沉淀，而清蛋白保持溶解状态，依此可将清蛋白和球蛋白分离。 【实验原理 】 蛋白质的呈色反应 考马斯亮蓝显色法 考马斯亮蓝G250（Coomassie brilliant blue）与蛋白质中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合，使溶液呈蓝色。此时蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。常用于快速定量分析。 考马斯亮蓝G-250 【仪器试剂】 血清、饱和硫酸铵溶液、标准蛋白溶液、 考马斯亮蓝G-250 722S型分光光度计； 标准曲线的绘制及标准曲线法 1 2 3 4 5 样品 标液 C1 C2 C3 C4 C5 CX A A1 A2 A3 A4 A5 AX A λ CX AX 1.标准曲线制作 （1）蛋白标准液的倍比稀释： 管 号 1 2 3 4 0.9% NaCl 200μl 200μl 200μl 标准蛋白溶液（1mg/ml） 由2中取200μl 由3中取200μl 由4中取200μl 400μl 1 0.5 0.25 0.125 蛋白质终浓度（mg/ml） 【操 作 步 骤】（Operating Procedure） （2）标准曲线的制作 管 号 0 1 2 3 4 考马斯亮蓝 G-250 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 0.9% NaCl 100μl 对应加入倍比稀释的 蛋白标准液 100μl 100μl 100μl 100μl 蛋白质含量（μg） 0 12.5 25 50 100 A595nm 将溶液充分混合，放置2min后开始测吸光度A595nm. 【操 作 步 骤】 （Operating Procedure） （一） 血清蛋白的盐析 取1.5 ml EP管1支+0.5 ml血清——滴加饱和硫酸铵0.5 ml（血清已被稀释了2倍），边加边混匀——室温静置5分钟后，10000rpm，离心2分钟——转移上清至另一支EP管内备用，此为盐析上清。 (二).血清中蛋白质浓度的测定 （1）血清样品的稀释：取2支1.5 ml EP管， 标记1号、2号，按下表稀释.留2号管备用。 管 号 1号 2号 0.9% NaCl 180μl 380μl 血 清 20μl 由1号中取 20