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第三章 细胞生物学的研究方法 第一节 显微镜技术 （一）普通光学显微镜（Light Microscope） 组成 （1）光学放大系统（目镜和物镜） （2）照明系统（光源、折光镜、聚光镜、滤光片） （3）机械和支架系统 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。 影响显微镜成像清晰度最关键的因素是显微镜的分辨率（resolution）。 分辨率是指能够区分相近两点的最小距离（R）。 显微镜的几个光学特点： 通常α最大值可达140°， sinα/2的最大值必然小于1；介质为空气中N=1 ；油镜头用香柏油为介质，N=1.515 普通光线的波长为400～700nm，因此，普通光镜的最大分辨率是0.2μm，人眼的分辨力为0.1mm,因此显微镜的最大设计倍数为500×。 （二）荧光显微镜（Fluorescence Microscope） 1-滤光片甲：仅让波长在450nm和490nm之间的紫外线通过 2-光束分离镜：反射波长510nm的光束，波长510nm的光束可通过 3-滤光片乙：滤掉多余的荧光信号，让520nm－560nm之间的绿荧光信号通过 （三）相差显微镜（Phase-contrast Microscope） 通过致密部分(如细胞核),速度慢通过疏松部位(如细胞质),速度快 二、电子显微镜技术 以波长比可见光短得多的电子束作为光源，用电磁透镜聚焦，电镜镜筒中要求高真空，图像用荧光屏（感光胶片）来显示（记录）； 分辨率可达0.2nm，有效放大倍数为106倍； 结构： （1）电子束照明系统（电子枪、聚光镜） （2）成像系统（物镜、中间镜、投影镜） （3）真空系统（两极真空泵） （4）观察记录系统 透射电子显微镜标本制备 由于电子束穿透能力有限，因此用于电镜的标本须制成厚度仅有0.05?m的超薄切片，并放在铜网上。这种切片需要用超薄切片机制作。 超薄切片技术 为便于电子穿透，获得高分辨率，需将样品切成极薄的薄片，即超薄切片技术（ultrathin section）。 第二节 细胞的分离和培养 流式细胞技术 流式细胞仪 (flowcytometer,FCM) （荧光激活细胞分选仪） 对细胞进行自动分析和分选的装置 原理： 用带有荧光的特异抗体标记待分离的细胞，然后在流式细胞仪中从未标记的细胞中分选出标记细胞。 应用： 细胞分选: 1cell in 1000 2w-5w cells/sec 离心技术 P44 离心机是借离心力分离液相非均一体系的设备。 根据物质的沉降系数、质量、密度等的不同，应用强大的离心力使物质分离、浓缩和提纯的方法称为离心。 离心原理:在离心力场的作用下，加速悬浮液中固体颗粒沉降（或漂浮）速度。 微粒在重力场下移动的速度 与微粒的大小、形态和密度 有关，并且又与重力场的强 度及液体的粘度有关。 离心是研究亚细胞成分和生物大分子的基本手段，将细胞器（细胞核、线粒体、高尔基体等）从细胞匀浆后悬液中分离出来。 转速为10~25krpm/min的离心机称为高速离心机。 转速25krpm/min，离心力89Kg者称为超速离心机。 目前超速离心机的最高转速可达100krpm/min，离心力超过700,000g。 制备细胞匀浆 细胞 匀浆液 （一）差速离心 差速离心（differential centrifugation）利用不同离心速度产生的不同离心力，将沉降系数不同的各种亚细胞组分和各种颗粒分开。 用于分离大小、形状显著不同的组分，根据颗粒沉降速度不同得以分离. 特点： （1）介质密度均一； （2）速度由低向高，逐级离心。 密度梯度离心 密度梯度离心（density gradient centrifugation）：将待分离的细胞组分铺放在不连续介质表面或内部，离心使细胞不同组分以不同速率沉降，形成不同沉降带。 类型：速度沉降；平衡沉降。 常用介质：蔗糖、多聚蔗糖、甘油、氯化铯 。 （二）速度沉降（velocity sedimentation） 用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 原理：制备梯度离心介质（密度由顶部到底部逐渐增加）,分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降，形成不同的沉降带而达到分离。 梯度特点:梯度平缓，密度较低( 5%-20%)，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 分离效率: 取决于沉降系数间的差异。 （三）平衡沉降（equilibrium sedimentation） 用途：分离大小、形态相似而密度不同的组分。 特点： （1）介质密度较高，陡度大(20%-70%） ，介质的最低密度应大于被分离组分的最大密度。 （2）所需的力场通常