微生物的大小测定与显微计数.docVIP

实验二 微生物的大小测定与显微计数 一、实验目的 学习并掌握用测微尺测定微生物细胞大小的方法。 了解血细胞计数板的构造及计数原理。 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。 二 实验原理 酵母菌大小测定 在显微镜下，测微尺可完成对微生物大小的测定。测微尺包括目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺是一块放入目镜中的圆形玻片，在玻片中央把10mm的长度刻成100等分，用于测量经显微镜放大后的细胞图像。测量前，需先用镜台测微尺校正。镜台测微尺是专门用来校正目镜测微尺的。 微生物数量的测定 血细胞计数板（图一）是一块特制的载玻片，薄片上有4条槽构成3个平台，中间较宽的平台又被一短槽隔成两半，每一边平台各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。 计数室（图二）的刻度有两种：一种大方格分为16个中方格，每个中方格分成25个小方格；一种大方格分成25个中方格，中方格分成16个小方格。每个大方格都是400个小方格，边长为1mm，面积1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。 三 实验仪器、材料和用具 实验用具：载玻片、盖片、200μ l移液器及tip、擦镜纸、 装有蒸馏水的洗瓶。 实验仪器：普通生物显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、血球计数板、手动计数器; 菌种 ：酿酒酵母（200rpm，28℃，24h，稀释20倍） 四 实验步骤 酵母菌大小测定 （1） 目镜测微尺的校正 目镜测微尺的目镜镜台测微尺某一个区域内两线完全重合。计数两重合刻度之间目镜测微尺和镜台测微尺的格数（格数必须是整数）。 （2） 细胞大小的测定 将稀释40倍的少量的酵母培养液涂在载玻片上，用盖玻片推开，放在载物台上。 用100倍镜观察，用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长、宽各占几格。测定20个菌体，统计计算。 （3）测定完毕后，将目镜测微尺和物镜测微尺擦拭干净包好归还 。 微生物数量的测定 菌液准备：将啤酒酵母在28℃，100r/min培养8h。40倍稀释（由助教完成）。 镜检计数室：加样前，对计数板的计数室镜检，若有污物需要清洗，干燥后使用。 加样品：将血细胞计数器中间平台盖上盖玻片用无菌水吸管将摇匀的啤酒酵母菌悬液由盖玻片的边缘滴一小滴，让菌液靠毛细渗透作用自动进入到计数室。 显微镜计数：加样后将血细胞计数板置于显微镜的载物台上，静置1min后，用4倍镜找到计数室，再换10倍镜进行计数。对两个计数室各计数一次。 酵母菌计数完毕后，马上将其用洗瓶冲洗，自然晾干，或者用擦镜纸轻轻擦干。 重新加样：按照前面的步骤再计数5次。利用公式计算出血细胞的数量。 五、实验结果 1. 酵母菌大小测定 已知镜台测微尺每格10μm，所以根据下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的实际长度： 物镜倍数（目镜10×） 目镜测微尺格数（小格） 镜台测微尺格数（小格） 目镜测微尺每格长度(μm) 100× 111 11.0 0.99 表一 目镜测微尺标定结果. 菌号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 目镜测微尺格数（长轴） 9.1 8.5 8.0 8.9 8.1 6.3 9.2 7.2 7.0 8.5 目镜测微尺格数（短轴） 6.0 6.0 6.9 8.0 6.0 5.3 7.2 6.8 6.8 6.1 菌号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 目镜测微尺格数（长轴） 6.9 7.1 7.1 8.0 8.0 9.0 7.0 10.0 9.0 7.0 目镜测微尺格数（短轴） 5.0 6.5 5.2 7.8 6.2 8 5.1 8.9 7.0 5.2 表二 酵母菌大小的测定结果(100×) 经计算得： 酵母菌长轴平均值 7.995×0.99μm＝7.92 μm 酵母菌短轴平均值 6.500×0.99μm＝6.44 μm 酵母菌体积平均值 =4πabc/3=172.04μm3 随机误差使测量值具有一定的分散性，实验标准偏差可用s表征，s可以用贝塞尔公式算出： 其中n在这次实验中为20 计算得μm μm 不确定度 = 0.468 所以μm；μm 综上，酵母菌长轴7.92 ±0.μm 酵母菌短轴6.44±0. μm 酵母菌悬液显微计数 实验次数 各中格中菌数 总细菌数 稀释倍数 平均值 菌数个/ml 左上 右上 右下 左下 中 1 19 12 13 16 15 75 40 66 1.3×108 2 12 13 17 10 10 62 3 12 10 14 12 13 61 4 17 10 21 19 19 86 5 14 11