皮肤成纤维细胞和角质形成细胞蛋白质组双向电泳图谱的比较.pdfVIP

皮肤成纤维细胞与角质形成细胞蛋白质组 双向电泳图谱的比较 陈斌 毕志刚 南京医科大学附属第一医院皮肤科 210029 摘要 目的：建立人皮肤成纤维细胞与角质形成细胞的双向凝胶电泳图谱，并利用计算机图像分析技 术初步分析其差异的蛋白质 方法：采用固相pH梯度双向凝胶电泳分离人皮肤成纤维细胞与角质形成细胞的总蛋白质，凝胶 Master2D图像分析软件进行比较分析，识别差异表达的蛋白质。 经银染显色后，．Imaging 两种细胞的双向凝胶电泳图谱，得到平均匹配蛋白点数为315±25。差异表达蛋白点数为281个，其 高表达，145个点在成纤维细胞中为低表达。 结论：本研究建立了分辨率高且重复性较好的人皮肤成纤维细胞与角质形成细胞的双向凝胶电 泳图谱，发现两者间存在一些差异表达的蛋白质，为皮肤蛋白质组学的进一步研究奠定基础。 关键词：皮肤成纤维细胞 角质形成细胞 双向凝胶电泳 蛋白质组 蛋白质组技术是后基因时代的重要研究工具，它利用高分辨双向电泳(2．dimensional 2．DE)对复杂组织进行蛋白质分离，然后采用生物质谱等技术对分离蛋白进行鉴定，通过对比研究， 能够从大量蛋白质中直接筛选出与种系、性别、年龄、疾病、损伤等因素有关的特异性蛋白质。目 前蛋白质组学技术在皮肤领域的应用尚处起始阶段，通过公开文献查询，目前国内还没有皮肤蛋白 质组学方面的研究报道，我们在这方面做了些前期工作，本研究应用固相pH梯度双向凝胶电泳技术 Maste2D 分离人皮肤成纤维细胞与角质形成细胞的总蛋白质，建立双向凝胶电泳图谱，采用Imaging 图像分析软件进行比较分析，识别差异表达的蛋白质，以期为蛋白质组学技术在皮肤病研究中的进 一步应用奠定基础。 材料与方法 一、试剂 固相pH梯度干胶条IPGslrip(pH3—10L，13cm)、immobilizedpn Covcrfluid，两性电解质(carrier 酶和RNA酶，均购自华美生物工程公司。低分子量蛋白标记物购自上海西巴斯公司。其余试剂为国 产分析纯。所用溶液均用去离子水配制。 二、仪器和软件 Labscan 2DPlatinumV 品。电泳仪(Bio—Rad300CX)。ImageMaster v3．00图像扫描软件、ImageMaster Pharmacia 5．0图像分析软件(瑞典AmershamBiotech公司)。 三、细胞培养 将传代接种于100mm培养皿中生长良好培养细胞消化下来，PBS洗3次，离心后取细胞团块提蛋白。 培养细胞消化焉，PBS洗3次，离心后取细胞团块提蛋白。 四、皮肤细胞蛋白提取 将蛋白裂解液(7mol／L尿素+2mol／L硫脲+209／L 取上清，贮存于．70。C，同时用Bradford法测定提取液中蛋白质浓度。 五、第一向固相pH梯度(immobilizedpHgradiear，IPG)‘ u 等电聚集主要按Gorg等的方法和IPGorg等电聚集指南进行，40gnaCaT细胞总蛋白加入重水 u DTT)至终体积250l。将 化液(8mol／L尿素，109／LNP240，少许溴酚蓝，59／LIPGbuffer，,2．89／L 109