实验七小鼠染色体制备与观察.docVIP

小鼠染色体制备与观察 【实验目的】 了解小白鼠睾丸细胞染色体的形态及数目。 初步掌握小白鼠睾丸细胞染色体的玻片标本制作方法。 观察动物细胞染色体的数目和形态。 【实验原理】 染色体是遗传物质的载体，它具有种属特异性，通常不同物种以不同亚种的核型是不同的。通过对各种动物染色体核型的研究可以丰富物种的信息系统，对了解物种的遗传变异进化以及物种的分类均有一定的意义。 真核细胞染色体的数目和结构是重要的遗传指标之一。制备染色体标本是细胞遗传学最基本的技术，优良的染色体制片是进行染色体显带、组型分析、原位杂交等的先决条件。 染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。小型动物的染色体制片最好最有效的材料就是骨髓组织。 骨髓细胞中，有丝分裂指数相当高，因此可以直接得到中期细胞而不必象淋巴细胞或、其它组织那样要经过体外培养；对大型动物通常采用对骨骼、脊或胸骨穿刺术吸取红骨髓，小型动物多采用剥离术取股骨以获得骨髓细胞。 对于小鼠精巢染色体标本的制作，一般包括以下几个要点: 1. 用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期, 使中期染色体停留在赤道面处; 2. 用低渗法使将细胞膨胀, 以至于在滴片时细胞被胀破, 使细胞的染色体铺展到载玻片上; 3.? 空气干燥法可使使细胞的染色体在载片上展平, 经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图象。 制作染色体标本的先决条件 细胞具有旺盛的分裂能力 选择活跃的组织：胸腺，骨髓，睾丸，小肠 施加药物使细胞分裂：PHA 设法得到大量的中期细胞：秋水仙素 PHA：粗细胞分裂，使淋巴细胞返幼，变为淋巴母细胞 秋水仙素：破坏微管装配，使纺锤体不能形成，使大量细胞停止在分裂中期。 低渗作用：水进入细胞内，细胞内容空间变大，染色体间的距离拉大，易于染色体展开 空气干燥：使细胞和染色体展开 固定：用甲醇：冰醋酸=3:1作用使蛋白质变性，对染色体内的组蛋白讲，变性后硬度增加，保持了染色体的“及时形态”，对细胞膜蛋白讲，变性使细胞膜硬度增强，形成屏障作用，防止了细胞内物质外溢和丢失。 染色体组型又名核型，是指根据染色体的长度、形态和着丝粒的位置将中期染色体依照所规定的标准顺序和组次予以系统排列而成的模式图，它代表了一个个体或物种的染色体特征。进行染色体组型主要依据有以下几个参数: 1. 相对长度(relative length): 指单个染色体的长度与包括X染色体在内的单倍体染色体总长度之比，相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X染色体)的总长度×100%。 2. 臂指数(arm index): 指染色体长臂与短臂的比率，臂指数=长臂/短臂。 3.? 着丝粒指数(centromere index): 指短臂占整个染色体长度的比率，着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%, 该比率决定了着丝粒在染色体中的相对位置。 4. 染色体的臂数: 对于端部着丝粒染色体，臂数为1，其它为2。根据Levan(1964)所制定的人类染色体标准，臂指数在1.0~1.7之间的染色体为中央着丝粒染色体，在1.7~3.0之间为亚中央着丝粒染色体，在3.0~7.0间为亚端部着丝粒染色体，大于7.0为端部着丝粒染色体；着丝粒指数在50.0~37.5之间的染色体为中央着丝粒染色体，在37.5~25.0之间为亚中央着丝粒染色体，在25.0~12.5之间为亚端部着丝粒染色体，小于12.5为端部着丝粒染色体。 【实验材料】 材料：小白鼠。 试剂：秋水仙素、0.3%KCl溶液、甲醇、冰醋酸、吉姆萨原液。 器械：手术刀、手术剪、镊子、试管架、解剖盘、注射器、针头、吸管、离心管、离心机、玻片(冰片)、天平、试镜纸、吸水纸、、烧杯、水浴锅。 【实验步骤】 取雄性小鼠以每克体重4ug注射秋水仙素，经14-16小时后，断头法杀死小鼠，取出睾丸，用生理盐水（0.9%的NaCl）吸去血污。 放入装有1ml 0.3% KCl 液的小烧杯中剪碎（呈乳白色）。 用铜网过滤到刻度离心管中，再加0.3% KCl 液至4ml。 37℃ 静置30分钟，进行低渗处理。 以800-1000转/分 离心8分钟。 弃上清液，加入2ml甲醇、冰醋酸固定液（3:1），并用吸管吹气，轻轻打散细胞，固定8min。 再以800-1000转/分，离心8min。 弃上清液，加1ml固定液，制成细胞悬液，固定5min。 取洁净的低温预冷载玻片，距10-15cm高度滴下2-3滴细胞悬液，从一边轻轻吹气，并随时轻轻敲打，以使细胞均匀分布和促使染色体展开。 用滤纸擦去载玻片上多余液体，空气干燥或文火干燥，染色。 【实验结果】 第一张标本观察结果如下： 图一 染色体制片一观察