生物学研究方法1.pptVIP

* High sample load (protein disturbs separation of other spots or may not be fully saturated with SDS)Hint: Lower the protein amount * Impurities on or within the 2-D gel still present during silver stainingHint: Clean the gel cassettes prior casting with ethanol Incubate the 2-D gels long enough (and with at least 100 ml/ gel) in fixing and washing solution prior staining * 关键问题 样品制备是关键，务必使蛋白样品充分裂解，除去颗粒性物质，如核酸、糖，盐及去污剂等的影响 要注意蛋白从第一向到第二向的转移，可用分离胶直接封闭IPG胶条 为了提高银染的效果，玻璃板和染色盘一定要清洗干净 如要进行差别蛋白组分析，银染的方法要注意和质谱分析相匹配 * 如何提高2DE分辨率 首先采用宽pH范围的胶条，确定蛋白的分布范围，通常采用pH3-10的胶条 如果pH线性分布的胶条分离效果不好，可采用非线性胶条 加大蛋白上样量，提高局部蛋白的分辨率 采用窄pH范围的胶条，提高某pH范围蛋白的分辨率 第二向采用梯度胶进行分离 去除高丰度蛋白，进行蛋白的fractionation处理,富集低丰度蛋白 * 采用窄范围pH胶条对pH4-7的2D胶进行局部分辨率提高的分析举例 * pH4-7胶条分析的2D胶图谱 * pH4-5胶条分析的2D胶图谱 * pH4-5胶条分析的2D胶图谱 * pH5.5-6.7胶条分析的2D胶图谱 * 如上所示：通过分别用pH4-5,pH4-6,pH5.5-6.7的窄pH范围胶条，较单独用pH4-7的胶条，可大大提高局部区域的分辨率，使检测到的点数大大增加。 * Pre-及subfractionation方法 Isolation of cell compartments and /or organelles, e.g., by sucrose gradient centrifugation; Selective precipitation of certain protein classes (e.g., TCA/acetone); Sequential extraction with increasingly powerful solubilizing buffers,e.g., aqueous buffers, organic solvents such as ethanol or chloroform/methanol, and detergent-based extraction solution Chromatographic separation method 胶内差别电泳(difference in gel electrophoresis, DIGE) 一种改进的进行差别分析的2DE方法 * DIGE分析特点 将样品和对照品用荧光染料进行标记，在同一块胶内，对样品和对照品进行双向电泳分析，为一种改进的2DE方法。 * DIGE分析流程图 * DIGE的优点 在DIGE时，由于样品和对照在同一胶内分离，使用相同的内标，避免了使用不同凝胶时在操作上的偶然性和不平行性，可以准确检测出两个不同样品蛋白表达上的差别，消除胶与胶之间的差异，保证统计上的可靠性及操作上的重复性。荧光标记较其他染色方法灵敏度更高。与常规的双向电泳技术比较，DIGE更加简单，劳动强度大大降低，效率大大提高。 * 双向电泳的应用 分离复杂的蛋白质组：包括系统分离(systematic separation)，鉴定(identification)及定量(quantification); 预测蛋白质的翻译后修饰； 差别表达蛋白质组分析，研究细胞分化、寻找疾病相关的生物标记分子、进行疾病治疗情况的监测、药物开发及癌症研究等。 * * * * * * * * * * * * * * * 采用安玛西亚公司IPG Phor等电聚焦仪，pH 3-10的非线性胶条，蛋白上样量250μg，体积350μl。电流为50μA／strip，所用电泳条件为30V,12h;100v,1h; 500v, 1h;1000v,1h; 8000v,1h(gradient); 8000v,10h，共用时26h，IEF结束后vhs为80000左右。 * various lengths : 5 - 24 cm