检验方法汇编02.docVIP

第四部分 冰淇淋微生物检验方法 一、大肠菌群检验………………………………………………第110页 二、菌落总数的测定……………………………………………第117页 三、嗜冷菌的检测………………………………………………第120页 四、单核细胞增生李斯特氏菌的检验…………………………第120页 五、涂抹检验……………………………………………………第125页 六、空气净度检验………………………………………………第126页 七、水样的检测…………………………………………………第127页 一、大肠菌群检验（依据国标GB/T4789.3-2003） （一）概念： 大肠菌群：经37℃24h培养，能发酵乳糖，产酸、产气，需氧或兼性厌气的G-无芽胞杆菌。该菌主要条件来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中是否有污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100ml（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。 （二）培养基配制： 1.乳糖胆盐发酵管： 成分：蛋白胨20g 胆盐5g 乳糖10 g 0.04%溴甲酚紫水溶液25ml 蒸溜水1000 ml PH 7.4 制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正PH加入指示剂，分装每管10ml，并放入一个小倒管，115。C高压灭菌15min。 注：双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其它成分加倍。 2.乳糖发酵管： 成分：蛋白胨20g 乳糖10 g 0.04%溴甲酚紫水溶液25ml 蒸溜水1000 ml PH 7.4 制法：将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正PH值，加入指示剂，分装3--5 ml，并放入一个小倒管，115。C高压灭菌15min。 3. 伊红美蓝培养基： 成分： 　　蛋白胨　　　　　　　10g 　　乳糖　　　　　　　　10g 　　磷酸氢二钾　　　　　2g 　　琼脂　　　　　　 17g 　　2％伊红水溶液　　　 20ml 0.65％美蓝水溶液　 13ml　 蒸馏水　　　　　 1000ml pH为7.1 制法： 　　将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于热蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内， 121℃高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50-55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。 （三）大肠菌群检验程序： （四）操作程序： 1.检样稀释 （1）以无菌操作将检样25ml（g）灭菌盐水→取菌→ 火焰上固定→结晶紫染色1min水洗→革兰氏碘液染色1min→水洗→95%乙醇染色30S→水洗→复染液染色1min→水洗→待干→镜检。 大肠菌群采用三步法（初发酵，分离培养和证实试验） 第一步乳糖发酵试验是样品的发酵结果，不是纯菌的发酵试验，所以初发酵阳性管，经平板分离和证实实验后，有时可能成为阴性。因此，初发酵与证实实验相差较大。 5.报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（g）g 95%乙醇 30ml 0.01%氢氧化钾溶液 100ml 将美蓝溶解于乙醇中，然后于氢氧化钾溶液混合。 （2）染色法 将涂片在火焰上固定，待冷。滴加染液，染1-3分钟，水洗，待干，镜检。 （3）结果：菌体呈兰色。 2.革蓝氏染色法： （1）原理：G-菌（革兰氏阴性菌）细胞壁厚，细胞壁中脂类化合物多，含肽聚糖少，酒精溶解脂类，细胞壁通透性好，酒精可以碘和结晶紫的复合物溶出，番红进入→红色。 G+菌（革兰氏阴性菌）细胞壁薄，细胞壁中脂类化合物少，含肽聚糖多，细胞壁通透性差，碘和结晶紫的复合物滞留→蓝紫色。 （2）染液的配制： 1）结晶紫染液：结晶紫1g + 95%乙醇20ml + 1%草酸铵水溶液 80ml，将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 2）革蓝氏碘液：碘1g + 碘化钾2g + 蒸馏水300ml，将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，等完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。 3）沙黄复染液：沙黄0.25g + 95%乙醇10ml + 蒸馏水 90ml，将沙黄溶解与乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 （3）染色法： 1)用接菌环取一滴灭菌生理盐水于载玻片上，然后再用灭菌环挑取少量菌种于载玻片上与生理盐水充分混合。 2)涂片自然干燥或在火焰上固定，滴加结晶紫，染1分钟水洗。 3)滴加革蓝氏碘液，作用1分钟，水洗。 4)滴加95%乙醇脱色，约30秒；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10秒。 5)水洗，滴加复染液，复染1分钟。水洗，待干，镜检。 （3）结果：革蓝氏阳性菌呈紫色。革蓝氏阴性菌呈红色。 附：大肠菌群最可能数（MPN）检索表 阳性管数 MPN 100mL(g) 95%可信限 1ml(g)×3 0.1ml(g)×3 0.01ml(g)×3 下限