分子生物学第05章核酸的分子操作.pptVIP

5 核酸的分子操作 工具酶的种类 工具酶的来源 限制性内切酶的发现 限制－修饰假说 限制－修饰假说图示 完全甲基化和不完全甲基化 各种类型限制性内切酶的性质比较 Ⅱ型限制性内切酶的特点 表5－2 部分Ⅱ型限制性内切酶及其切割位点 限制性内切酶切割位点的多寡 同裂酶和同尾酶 同尾酶切割后连接的结果 Ⅱ型限制性内切酶所需反应条件 Ⅱ型限制性内切酶所需反应条件 限制性内切酶的命名 核酸的凝胶电泳 溴化乙锭结构式 表5－3 凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围 DNA大小与迁移距离的关系 DNA分子的状态与迁移速度的关系 大分子DNA的电泳分离 脉冲电泳 交变脉冲垂直定向电场电泳 电场倒转凝胶电泳，FIGE 电场倒转凝胶电泳的分离效果 垂直凝胶脉冲电泳 钳位均匀电场脉冲电泳 钳位均匀电场电泳的电极分布（CHEF） 物理图谱的定义 图5－1 多限制酶消化法制作物理图谱 图5－2 部分消化法制作物理图谱 DNA聚合酶的性质 测序酶 DNA聚合酶的5’→3’聚合酶活性 切口平移标记核酸探针 图5－4 切口平移法制备32P标记的探针 Klenow片段的产生 随机引物标记法制备探针 图5－5 采用Klenow酶的随机引物标记法 逆转录酶 逆转录酶 T4 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶 末端脱氧核苷酸转移酶催化的反应 碱性磷酸酶 两种碱性磷酸酶 碱性磷酸酶的用途 T4 多核苷酸激酶 T4 多核苷酸激酶催化的反应 大肠杆菌DNA连接酶的特点 DNA连接酶催化的反应 T4 DNA连接酶的特点 T4 RNA连接酶 S1核酸酶（米曲霉） Bal 31核酸酶 Bal31核酸酶催化的反应 DNase Ⅰ（牛胰） 外切酶Ⅲ（大肠杆菌） 分子杂交 印 迹 分子杂交 Sothern 杂交 Southern 印迹 Southern杂交过程 Northern印迹 斑点印迹和狭线印迹 滤膜杂交 杂交后的显色类型 生物素-11-dUTP和生物素-14-dATP的结构 地高辛-11-dUTP的结构 酶联免疫法测杂交信号 原位杂交 菌落或噬菌斑原位杂交 组织、细胞空间定位原位杂交 菌落或噬菌斑原位杂交筛选文库的基本过程 琼脂糖凝胶电泳→碱变性→中和→印迹到膜上→80℃（真空）烘烤2小时→预杂交→杂交→显带 尼龙膜可用毛细管转移和电转移，还可以用真空转移装置进行真空转移。在以尼龙膜为固相载体时，采用双链DNA转移到膜上后再碱变性。 将RNA进行变性和凝胶电泳后，转移到膜上的过程称为Northern blotting。此法的基本原理与Southern blotting相同，只是不能采用碱变性，因为碱会破坏RNA。RNA的分离采用变性凝胶电泳，变性剂为甲醛或乙二醛。提取、纯化和分离RNA容易受到RNase的破坏，RNase耐高温，100℃煮沸不能灭活RNase。实验所用的容器、试剂可用高压灭菌、焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）处理、试剂中加入RNase抑制剂、戴手套等排除RNase的破坏作用。 将变性后的样品不经分离，采用抽真空的方法将加在多孔加样器上的核酸样品直接转移到膜上，再行杂交。此法主要用于定量，如基因的表达丰度（测某种mRNA的量）。 为了减少探针的非特异性结合，降低背景，使杂交条带清晰，必须先行预杂交。预杂交液中含有经变性并断裂成片段的鲑鱼精子DNA或酵母DNA，以及SDS，还含有Denhardt试剂或肝素或脱脂奶粉之一。Denhardt试剂由聚蔗糖（Ficoll）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和牛血清白蛋白（BSA）组成。 预杂交后进行杂交。预杂交和杂交可在杂交袋中进行，按0.2ml/cm2的量加预杂交液，热封口，保温后剪开口子，加入标记探针，再热封口，保温。也可以使用杂交箱，杂交箱适用于大面积膜的杂交。 根据标记物的不同，采用相应的显色方法。如放射自显影、酶联免疫显色（地高辛、生物素）、化学发光、荧光。 A D D D B 0.5 2.2 1.3 1.0 32 P 5.0 kb 4.0 2.7 0.5 低 中 无 高 T4 DNA聚合酶 高 高 无 高 天然T7 DNA聚合酶 高 高 无 低或无 化学修饰T7 DNA聚合酶（测序酶） Taq DNA聚合酶 逆转录酶 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶） 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 酶 无 无 低 低 3＇→5＇外切酶 有 无 无 有 5＇→3＇外切酶 高 低 中 中