分子生物实验报告.docVIP

真核基因组DNA的提取 实验目的 掌握真核生物基因组DNA分离纯化的原理和方法： 学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理； 掌握基因组DNA的电泳分析。 实验原理 真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。得到纯度较高的DNA样品。 实验材料 试剂：细胞裂解缓冲液 500μl 、SDS 10%、 EDTA 、NaCL 、Tris-HCl 、蛋白酶K 10mg/mL、TE缓冲液、酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）、70%乙醇、3M NaAc、上样缓冲液 仪器：低温高速离心机、移液器、振荡器、Tip枪头、Ep管、试管架 常见问题 1、DNA样品不纯 2、DNA降解 3、DNA提取量少 RNA的提取 实验目的 掌握RNA分离纯化的原理和方法： 掌握RNA的电泳分析。 实验原理 Trizol试剂可迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核中的RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离。 细胞裂解后的裂解液内除了RNA外，还有DNA、蛋白质和细胞残片，通过氯仿等有机溶剂抽提离心，可将RNA与其他细胞组分分离开来，得到纯化的总RNA。 实验材料 试剂：Trizol、变性液、苯酚、氯仿、异戊醇、75%乙醇 仪器：低温高速离心机、移液器、振荡器、Tip枪头、Ep管、试管架 注意事项 1、避免制备的RNA的降解：提取RNA时不要太通风，可用DEPC配制的70%的乙醇擦喷洒桌面。 2、配制的各种溶液应用0.1%的DEPC处理，然后高压去处DEPC。 主要用途 RNA分析主要用于：1、反转录PCR、cDNA合成及文库构建；2、Northern印记杂交 质粒DNA的提取与酶解鉴定 实验目的 1、了解质粒DNA的特性，掌握碱裂解法、分离、提取质粒DNA的原理和方法； 2、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法； 实验原理 质粒DNA的分离关键：如何使质粒DNA与宿主染色体DNA分开。 碱裂解法是基于线性大分子染色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的的，在碱性环境中，线型染色体DNA和环型质粒DNA氢键会发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分离；当将pH值调节到中性并在高盐浓度下，已分开的染色体DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构，通过离心，大部分染色体DNA、不稳定的大分子RNA和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合环状的质粒DNA在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，离心后上清中便含有所需要的质粒DNA。 碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。 实验试剂 溶液1－GET缓冲液：100 (l （50mmol/L 葡萄糖，10mmol/L EDTA， 25mmol/L Tris-HCl pH8.0） 溶液2－200 (l ：（H2O120 (l ， 1mol/L NaOH 40 (l ， 5%SDS 40 (l ） 溶液3－醋酸钾溶液(pH=4.8)： 150 (l 酚：氯仿(1:1) ， 100%乙醇，70％乙醇 ， TE缓冲液: 30-50(l ， 10mmol/LTris-HCl ， 1mmol/L， EDTA RNase : 1(l ， 核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa)； EcoR I酶解缓冲液(10× buffer H)； 琼脂糖； 溴化乙啶（EB）染色液。 注意事项 用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！！！ 实验结果 质粒DNA应呈现二或三条不同构型的条带，这时表明所提样品较纯。溴酚蓝前的荧光区是样品中存有的RNA杂质。若质粒DNA样品在迁移率小的地方还有荧光条带，表明质粒DNA样品中有细菌的染色体DNA污染。 聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段 实验目的 1、掌握PCR基因扩增的基本原理 2、熟悉PCR基因扩增技术的具体操作过程并学会使用PCR仪 实验原理 多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction， 简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。典型的PCR由高温变性、 低温退火和适温延伸三步反应组成