中国药品检验标准操作规程2010版 细菌内毒素检查法.docVIP

细菌内毒素检查法 1 简述 1.1 本规范适用于《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ E细菌内毒素检查法——凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.2 供试品细菌内毒素限值的确定 1.2.1 药典中或国家标准有规定的，按供试品各论中规定限值； 1.2.2 尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： L＝K∕M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU／ml、EU／mg、EU／U等表示。 K为按规定的给药途径，人用每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU／(kg·h) 表示。其中注射剂，K＝5EU／(kg·h)；放射性药品注射剂，K＝2.5EU／(kg·h)；鞘内用药品，K＝0.2EU／(kg·h)。 M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml／(kg·h)、mg／(kg·h)、U／(kg·h) 等表示。 药品人用最大剂量可依据药品使用说明书或参阅《临床用药须知》，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于1h的按1h计。若供试品按体表面积给药，供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量［即M：（最大给药剂量／(m２·h)×1.62m２）／60kg］。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数（MVD）按下式计算： MVD＝C·L／λ L为供试品的细菌内毒素限值，当L以EU／ml表示时，C等于1.0ml／m1；当L的单位以EU／mg或EU／u表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg／ml或U／ml。 λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。 供试品如为无菌粉末或原料药，供试品最小有效稀释浓度（MVC）按下式计算：MVC＝λ／L。 1.4 药典或国家标准或其他内毒素检验标准中已有规定的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰试验的验证；其他未建立内毒素检查的品种需先进行干扰试验的研究，确定限值和不干扰浓度后再进行内毒素检查。 2 实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用，精度为0.1mg以下。 2.2 电热干燥箱用于去除外源性内毒素，温度应能达到250℃。 2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±1℃）。 2.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1℃以下。 2.5 旋涡混合器。 2.6 鲎试剂，应具有国家主管部门的批准文号。 2.7 细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品，除另有规定外，应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品。 2.8 细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU／ml（用于凝胶法）或0.005EU／ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。 2.9 实验用具 移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝集管（10mm×75mm）、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、封口膜、时钟、75％乙醇棉、剪刀、砂轮。所用玻璃器皿须经250℃干烤30分钟以上。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。 2.10 细菌内毒素光度测定仪器。 3 实验准备 3.1 玻璃器皿的洗涤 将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液控干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，控干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入电热干燥箱。 3.2 玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素的去除 玻璃器皿置干燥箱后，将干燥箱调至250℃，待干燥箱温度升至设定的温度后开始计时，250℃干烤30分钟以上。达到规定时间后，关断电源，待干燥箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。 3.3 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH值在6.0～8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 4 凝胶法操作方法 4.1 鲎试剂灵敏度复核 鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。 因此要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂进行供试品干扰试验或供试品细菌内毒素检查前必须进行鲎试剂灵敏度复核试验