荧光定量PCR技术及其在动物病毒病定量检测中的应用_马莉.pdfVIP

增刊 马莉 ,岳华 ,黄兴 ,傅安静 ,李定霏 ,谢秀兰 ,刘小银 :荧光定量 PCR 技术及其在动物病毒病定量检测中的应用 　　　69 文章编号 : 1003—2843 (2005) ZK—0078—04 荧光定量 PCR 技术及其在 动物病毒病定量检测中的应用 马莉 ,岳华 ,黄兴 ,傅安静 ,李定霏 ,谢秀兰 ,刘小银 (西南民族大学生命科学与技术学院 ,成都 61004 1) 摘 　要 :荧光定量 PCR 技术是一种核酸定量技术 ,该技术在 PCR 反应体系中加入荧光基团 ,利用荧光信号累积实时监测 整个 PCR 进程 ,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法. 该技术具有特异性强 、灵敏度高 、重复性好 、定量准 确 、速度快 、全封闭反应等特点 ,因此在动物病毒病的检测中 ,荧光定量 PCR 技术不但能定量检测病原体感染的强弱和在 机体内的分布 ,还具有灵敏 、快速 、省力的特点. 关键词 :荧光定量 PCR;动物病毒病 中图分类号 : S852. 6　　　　　　　　文献标识码 : A 　　　　 　　荧光定量 PCR 技术是于 20世纪 90 年代由美国 App lied B io system s公司推出的一种新型核酸定量技术 [ 1 ] . 该 技术实现了 PCR 从定性到定量的飞跃 , 同常规 PCR 法相比,该方法特异性和可靠性更强 ,能实现多重反应 ,且采 用了完全闭管检测 ,不需 PCR 后处理 ,有效解决 PCR 污染问题以及 EB 对试验人员的伤害 ;再配以相应的荧光 PCR 仪 ,使整个 PCR 过程实现自动化 ,加之具有耗时短 ,操作方便等特点而备受推崇 , 因而广泛应用于基因表达 ( ) 研究、转基因产品安全检测 、单核苷酸多态性 SN P 研究及病原体检测等领域. 本文对荧光定量 PCR 技术的原理 及其在动物病毒病定量检测中的应用进行综述. 1　荧光定量 PCR 技术的原理 所谓荧光定量 PCR 技术 ,是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 进程 ,最 后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法. 在荧光定量 PCR 中,对整个 PCR 反应扩增过程进行了实时的监 测和连续地分析扩增相关的荧光信号 ,随着反应时间的进行 ,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线. 在 PCR 反应早期 ,产生荧光的水平不能与背景明显地区别 ,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期 ,因此可以 在 PCR 反应处于指数期的某一点上来检测 PCR 产物的量 ,并且由此来推断模板最初的含量. 为了能准确判断样品 ( ) ( ) 中某基因转录产物 mRNA 的起始拷贝数 ,荧光定量 PCR 采用新的参数 —Ct值 ,所谓 C代表循环 Cycle , T代表阈 ( ) [ 2 ] 值 Threshold . Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数 . 研究表明,每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系 ,起始拷贝数越多 , Ct值越小. 利用已知起始拷贝数的标准品可做出 标准曲线. 因此 ,只要获得未知样品的 Ct值 ,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数. 2　荧光定量 PCR 技术的种类 目前荧光定量 PCR 技术所使用的荧光化学方法按照荧光产生原理可分为两大类 ,即染料法和探针法. 收稿 日期 : 2005 - 10 - 25 ( ) 作者简介 :马莉 1982 - ,女 ,西南民族大学生命科学与技术学院硕士研究生. 通讯作者 © 1994-2010 China Academic Journa