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常见组织细胞的培养方法 点击数： 78　 发表日期：2008-1-2 体内组织细胞在体外培养时，所需培养环境基本相似，但由于物种、个体遗传背景及所处发育阶段等的不同，各自要求条件有一定差别，所采取的培养技术措施亦不尽相同，现介绍个别组织细胞培养的要点如下:第一节 上皮细胞培养上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。以表皮细胞为例，用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞，其法如下（黑木凳志夫 1981）1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成0.5－1平方厘米小块。2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。3、换入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分钟。6、反复吹打，制成悬液。7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。第二节 内皮细胞培养内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞，对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子（TAF）等有很大价值。研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便，其法如下：1、产后新鲜脐带，无菌剪取10—15厘米长一段，如不能立即培养，可于12小时内保存于4℃。2、用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线绳扎紧，以防液体返流。3、用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0.1%的粗制胶原酶，充满血管，消化3—10分钟；注入口用线绳扎，以防液体返流。4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温PBS轻轻反复冲洗后，一并注入离心管中（此步骤可重复）。5、离心去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。第三节 神经细胞培养神经细胞（神经元）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等诱发转化。一． 设备： 无菌操作设备。二． 大型设备CO2培养箱：恒温5%、10%CO2维持培养液中pH值。倒置显微镜：用于每天观察贴壁细胞生长情况。解剖显微镜，用于准确地取材。常温冰箱：-4℃，用于保存各种培养液，解剖液和鼠尾胶。低温冰箱：-20℃--80℃，用于储存血清酶，贵重物品和试剂。电热干烤箱：用于消毒玻璃器皿。高压消毒锅：用于消毒培养皿，手术器械。过滤器：配制解剖液、培养液，必须过滤后才可使用，以去除细菌。渗透压仪，pH剂，天平等。三． 培养器皿及手术器械1 培养皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直径。2 培养板，24-40孔，可用于开放培养。3 培养瓶：4 吸管，常用1，5，10ml，均需泡酸、洗涤、灭菌后方可使用。5 各类培养液贮存器。6 小型手术器械。准备：一 配制培养液（1） 解剖液：以无机盐（去除Ca2+, Mg2+）加葡萄糖配制成PBS缓冲液，保持一定的渗透压和pH值。（2） 基础培养基（MEM）：主要为多种氨基酸，加入葡萄糖，双蒸馏水溶解。（3） 接种培养液：用于胰酶消化后的细胞分散，做成细胞悬液，其成分为MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%马血清，当天配制。（4） 维持培养液：接种后24h，全部换成此液，后每2周换一次，每次换1/2。其成分为MEM中含5%马血清，1%谷氨酰胺，及适量的支持性营养物质。二 培养基质 常用鼠尾胶、小牛皮胶，多聚赖氨酸，再涂胶三消毒培养皿的备用。所有培养器皿均需清水冲洗2-3d，达两次ddH2O，每遍洗