小鼠培养角朊细胞分离表达CD80CD86.pdfVIP

http :// 小鼠培养角朊细胞分离表达CD80/CD861 雷建军，程惊秋，李幼平，李胜富，张立，柯能文 四川大学华西医院卫生部移植工程与移植免疫重点实验室,成都 610041 摘 要： 有研究发现培养的皮肤角朊细胞膜片行同种异体移植后不发生明显的排斥，异基 因角朊细胞逐步被 自体角朊细胞代替。这一现象确切机制不清楚。我们应用免疫荧光、 b d RT-PCR技术，发现C57BL/6 (H-2 ) 和BALB/c (H-2)乳 鼠皮肤角朊细胞在 7 天的培养期 内，CD80 的表达量随时间延长而增高，但不表达CD86。同时发现培养的角朊细胞不表达IA/IE （MHC-II）分子，排除了Langerhans细胞的干扰 。混合淋 巴细胞培养试验发现有血清 培养 7 天的角朊细胞能刺激异基 因淋巴细胞增值 ，而对同基 因淋巴细胞无效。我们的 研究证 实培养的角朊细胞能表达CD80，但不表达CD86。这一结果提示角朊细胞有可能 成为抗原提呈细胞（抗原递呈细胞 ），激活免疫系统，导致异基因角朊细胞最终被排 斥。 关键词：共刺激分子 T 细胞激活 排斥反应 角朊细胞 1．引言 1975 年Rheinwald 、 Green发明了角朊细胞培养法，很多研究者试图应用该方法培养角 朊细胞膜片来治疗烧伤和皮肤溃疡等疾病。早期有研究者报道培养的角朊细胞行同种异体移植 后能长期存活，无明显的排斥反应。后续研究表明，移植后的角朊细胞并没有长期存活。通过 分析HLA-I类分子、Y染色体及DNA指纹图谱分析发现，异基因角朊细胞最终被排斥，由受者角朊 细胞替代[1]。这一现象的确切机制还不清楚。 角朊细胞被认为是一种非职业抗原提呈细胞，组成性表达MHC-I类分子，在IFN-γ作用下， 诱导表达MHC-II类分子。但一般认为无论在静息状态下还是通过IFN-γ诱导，角朊细胞都不表达 CD80 或其他CD28 的配体[2]。所以有研究者认为，角朊细胞缺乏CD28 配体，不能供有效的共刺激 信号活化CD4+T 淋巴细胞。将CD80 基因转入角朊细胞，发现这些转基因的角朊细胞即使没有活 化，也能象Langerhans细胞一样刺激同种异体淋巴细胞增值[2]或者诱发皮肤过敏反应。 我们的研究将观察乳鼠的角朊细胞在培养过程中是否表达共刺激分子 CD80/CD86 及培养 的角朊细胞能否刺激同种异基因角朊细胞增值。 2．材料和方法 2.1 实验动物 d b 纯系鼠BALB/c(H-2 )和C57BL/6(H-2 )由四川大学华西动物中心购于中科院上海生物 所。细胞培养用乳鼠为新生 1~3d,混合淋巴细胞反应用鼠为 8 周,18g。实验过程遵照四川大 1本课题得到教育部博士点基金资助 项目编号 SRFDP 20020610086 -1- http :// 学动物实验条例。 2.2 角朊细胞纯化 乳鼠乙醚吸入处死,75%酒精和 D-PBS(含庆大霉素 5ug/ml)清洗,收集腹背部皮肤,移入 含 100U/ml dispase(GibcoBRL)D-PBS4℃消化过夜。剥离表皮层,剪碎,0.05%Trypsin-EDTA 37℃消化 35min,单细胞悬液过 100 目筛网去除较大块未消化组织,40g 离心 5min,无血清培 养液重悬,再次离心。 参照以往研究高增殖活性的角朊细胞可快速黏附在整合素(integrins)基底膜上的特 性来纯化角朊细胞[3]。简言之,以IV型胶原提前打底,分离得到的单细胞悬液移入 6 孔板,贴 壁 1h后,清洗掉未黏附的细胞,一般种入 106 5 细胞可收获 10 贴壁细胞,更换完全培养基培养, 细胞增殖的起始密度一般在 2×105/ml,5%CO2,37℃孵育。 无血清培