第2章 基因工程制药(一).pptVIP

第二章 基因工程制药第一节 概述 基因工程技术可大量生产传统制药难以获得的生理活性物质，如胰岛素。干扰素、细胞因子等，保障了临床使用。 提供足够数量的生理活性物质，以便对其药物分子结构、生理生化做更加深入的研究； 利用基因工程，结合人类基因组计划，可以发现挖掘更多的内源性生理活性物质； 可以把内源性生理活性物质进行改造，克服做为药物使用时的不足之处。 利用基因工程可以获得新型化合物，扩大药物药物筛选来源。 第二章 基因工程制药第二节 基因工程药物的生产过程 基因工程制药由上游工程和下游工程组成。 上游工程是研究开发必不可少的环节，主要在实验室内完成。包括目的基因的分离、重组质粒的构建、组建基因工程菌 (或细胞) 等程序。 下游工程是把上游工程成果产业化的过程。包括确立工程菌株或细胞株大规模发酵的最佳参数、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术、生物传感器等一系列设备的制造、电子计算机的优化控制等。 基因工程药物制造的主要步骤： 第二章 基因工程制药第三节 目的基因的获得 由于生物药物大多数是真核基因的表达产物，因此，分离与克隆真核基因就成为基因工程制药上游工程的基础。克隆的任何基因都有知识产权归属，十分敏感，不能回避。 从基因组中分离与克隆真核基因十分困难，要求了解基因在染色体上的精确位置、必威体育精装版的分子生物学实验技术和手段、具有一个高素质的科学研究队伍、有足够的资金支持。 另外，若想使分离与克隆的真核基因在原核细胞中表达也必须对基因再改造。 比较快地得到药物基因的方法是走cDNA克隆路线。 cDNA克隆示意图 第二章 基因工程制药第三节 目的基因的获得 cDNA的克隆 包括cDNA与载体的重组和载体转化细胞两个步骤 表达型载体、非表达型载体 1.?质粒型载体—环状dsDNA分子，自主复制 2.?病毒型载体—环状、线状、ss-和ds-DNA分子，形成病毒颗粒 3.混合型载体—具质粒和病毒特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性 cDNA片段与载体的连接（1） 第二章 基因工程制药第三节 目的基因的获得 目的基因cDNA的分离与鉴定① 与克隆载体重组的cDNAs包含细胞中的所有的mRNAs的逆转录产物，其中只有一个产物是目的基因的cDNA。所以，被这些重组载体转化的大肠杆菌细胞构成了一个cDNA文库。下一步就是从这个文库中筛选出含有目的基因的cDNA的克隆。目前可以用两种方法完成这个筛选过程： ⑴ 核酸探针杂交法： 用层析法或高分辨率电泳技术 (蛋白质双向电泳技术或质谱技术)分离出确定为药物的蛋白质，氨基酸测序，按照密码子对应原则合成出单链寡聚核苷酸，用做探针，与cDNA文库中的每一个克隆杂交。这个方法的关键是分离目的蛋白，oligo-polynucleotide探针只需 ?g 级的量。 核酸探针杂交法 第二章 基因工程制药第三节 目的基因的获得  目的基因cDNA的分离与鉴定② ⑵ 免疫反应鉴定法：只能针对用表达型载体构建的cDNA文库的筛选。 cDNA文库中的每一个克隆都只能表达一条多肽链，而做为药物的蛋白质也可能是多肽链复合体，即由几个亚基组成。这样，就难以确定DNA探针。但可以制备药物蛋白的单克隆抗体，与文库中的每个克隆的表达产物逐一做免疫反应检测，获得阳性反应克隆。 酶联免疫吸附检测 (enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA)是经常使用的方法。 酶联免疫吸附检测 (enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA) 第二章 基因工程制药第三节 目的基因的获得 二、逆转录－PCR法 用PCR直接从细胞总体mRNAs中扩增cDNA是目前最流行的方法。 采用SUPERSCRIPT II逆转录酶 (GIBCO BRL)，并在cDNA第一链的3’端附加poly(C)，保证mRNA分子上的信息不丢失。这个方法不要求纯化mRNAs，并且可以把细胞中痕量mRNAs的cDNAs扩增出来。 反转录—PCR反应 第二章 基因工程制药第三节 目的基因的获得 三、化学合成法 有些基因可以从相关资料中查得其核苷酸顺序，有些蛋白质药物的氨基酸顺序也已经被确定，只要涉及的核苷酸顺序不太长，就可以用DNA自动合成仪化学合成。 按照蛋白的氨基酸顺序推定基因的DNA顺序，“密码子简并”和“密码子偏爱”会带来一些麻烦；目前国内的生物技术公司的DNA合成价格不断下降，合成的费用并非难以承受。 “人类基因组计划”的成果可以共享，很多资料和数据可以从美国的“国家生物技术信息中心” 网站 (Http:///)获得。 第