鹿种鉴定技术规范（征求意见稿）.docVIP

前 言 本标准按照GB/T 1.1-2011给出的规则起草。 本标准的附录A为附录附录规范性附录。本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局 件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 ３ 方法原理 根据GenBank数据库中已公布的梅花鹿、马鹿的线粒体基因组序列，根据种内具有保守性、种间具有特异性的原则选择合适的区域，设计、合成3条引物，样本经过提取总基因组DNA后，利用设计的特异性引物，对梅花鹿、马鹿的目的基因进行PCR扩增，根据PCR扩增结果判定判断样品中是否含有梅花鹿、马鹿的基因。梅花鹿、马鹿形态特征参见附录Ａ。 4 主要仪器设备 PCR仪、组织研磨器、超净工作台、制冰机、高速冷冻离心机、水浴锅、台式小型离心机、常规冰箱、旋涡振荡器、电泳仪、凝胶成像系统、微量可调移液器（10μL、100μL、1000μL）及配套吸头。 5　试剂与材料 5.1　无水乙醇。 5.2　蒸馏水(应符合GB/T 6682 中一级水的规格)。 5.3　蛋白酶Ｋ(20mmol/μL)。 5.4　十二烷基磺酸钠（SDS）。 5.5　十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）。 5.6　氯化钠。 5.7　三氯甲烷。 5.8　异戊醇。 5.9　饱和酚。 5.10　70%乙醇。 5.11　TE缓冲液。 5.12　Taq DNA聚合酶。 5.13　dNTP。 5.14　10倍缓冲液（Mg2+ PLUS）。 5.15　琼脂糖、电泳缓冲液等（试剂配制见附录Ｂ）。 5.16　引物对如下: DFP1:5’-CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’， DRP2:5’- CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’， RDFP3:5’- CATGTATAACAGTACATGAGTTAGCG-3’。 用双蒸水将引物稀释为20μmol/L工作浓度，-20℃保存备用。 6 检测方法 6.1 样品的处理 6.1.1 血液或精液样品：可直接使用200μL新鲜或冷藏、冷冻的均可。 6.1.2 动物组织、血凝块或毛发：置于液氮中充分研磨，再将所研磨的材料放入1.5 mL的离心管中。 6.2 样品DNA的提取 可使用等效的商品化DNA提取试剂盒，按操作说明书进行操作，也可采用以下方法提取DNA。 6.2.1 取血液／精液或在液氮下充分研磨的组织样品，加入50μL SDS／12.5μL蛋白酶Ｋ，充分混匀，65℃ 水浴加热10min。 6.2.2　加100μL 65℃预热的CTAB，上下颠倒混匀，65℃ 水浴加热20min。 6.2.3 加入等体积的Tris-饱和酚，混匀。 6.2.4 取上层水相于新管，加入等体积的酚∶三氯甲烷∶异戊醇（25:24:1）混匀，12000r/min室温离心5min。 6.2.5 取上层水相于新管，加入等体积的三氯甲烷混匀，12000r/min室温离心5min。 6.2.6 取上层水相，加入十分之一体积3M 的醋酸钠，混匀，再加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀，置于 -20℃2小时以上或过夜，12000r/min 室温离心15min。。 6.2.7 弃上清，加入1 mL预冷的70% 的乙醇，12000r/min室温离心5min。 6.2.8 吸弃残留液体，室温干燥10min左右，用50μL TE 缓冲液或ddH2O溶解，-20℃保存备用。 6.3 DNA浓度和纯度的测定 取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的吸收值或DNA浓度，260吸光值/280吸收值之间的比值在1.7-1.9之间时，适宜于PCR扩增。 6.4 PCR扩增检测 6.4.1 PCR反应体系组成 10×PCR 缓冲液 5.0 uL dNTPs(2.5 mmol/L) 5.0 uL DFP1或RDFP3（20 pmol/uL） 1.0 uL DRP2（20 pmol/uL） 1.0 uL 样品 DNA 2 uL Ex Taq DNA 聚合酶 0.5 uL 灭菌水 35.5 Ul 总体积为50uL体系，用漩涡混匀器进行混匀，瞬间离心，4℃备用。注：也可采用商品化试剂盒的PCR扩增体系。样品检测时，同时要设阳性对照和空白对照。 6.4.2 PCR程序及P1/DRP2反应体系的条