实验二蛋白质的性质实验(一).pptVIP

西南大学药学院生物制药实验室 实验二 蛋白质的性质实验（一）蛋白质及氨基酸的呈色反应 实验目的 了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式 了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 定量测定蛋白质的方法： 凯氏定氮法 双缩脲法 茚三酮法 Folin-酚（lowry法） 考马斯亮蓝G250法 紫外吸收法 实验原理 双缩脲反应 蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量氨基酸成分无关，因此利用此进行比色测定蛋白质含量。 在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540—560nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知的蛋白质浓度，标准蛋白溶液可以用结晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。 实验原理 实验原理 黄色反应 蛋白质溶液遇硝酸后先产生白色沉淀加热则白色沉淀变成黄色再加碱颜色加深呈橙黄色这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化产生了黄色硝基苯衍生物( 硝醌酸钠）。绝大多数蛋白质均含有芳香族氨基酸，因此都有黄色反应 实验原理 考马斯亮蓝反应 实验仪器及试剂 考马斯亮蓝G250 0.5%苯酚 浓硝酸 0.1%茚三酮 尿素 1%硫酸铜 2%卵清蛋白溶液 实验步骤 双缩脲反应 取少量尿素结晶于干燥的试管中，用微火加热熔化 → 尿素重又开始硬化时停止加热 → 可见到氨气释出 → 冷却后加入 10% NaOH 溶液约 1 ml，振荡混匀 → 加 1 % CuSO4 溶液 1 滴，振荡 → 观察颜色变化 取 1 ml 卵清蛋白溶液于干燥的试管中 → 加 10% NaOH 溶液约 2 ml，摇匀 → 加 1 % CuSO4 溶液 2 滴，随加随振荡 → 观察颜色变化 实验结果 按要求填写四张表格 （一）双缩脲反应 （二）茚三酮反应 （三）黄色反应 （四）考马斯亮蓝反应 * * N 端 C 端 尿素 双缩脲 紫红色络合物 双缩脲反应 实验原理 在弱酸条件下（pH5-7），蛋白质或氨基酸与茚三酮共热，可生成蓝紫色缩合物。 此反应为一切蛋白质和α-氨基酸所共有(亚氨基酸如脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色化合物)。 含有氨基的其他化合物亦可发生此反应。 硝基酚(黄色) 邻硝醌酸钠(橙黄色) 考马斯亮蓝G250在酸性溶液中以游离形式存在(呈棕红色)，当与蛋白质通过疏水作用力结合后变为蓝色。它的染色灵敏度比氨基黑高 3 倍，反应速度也快(~2 min 内即可达到平衡点)。 在 0.01~1.0 mg Pr 范围内，[ Pr ] 与 A595 nm 值成正比。 茚三酮反应 取两只试管，分别加入 2% 的卵清蛋白溶液和0.5% 的 Gly 溶液 1 ml → 各加 0.5 ml 0.1% 的水合茚三酮溶液，混匀 → 在沸水浴中加热 1~2 min → 观察颜色变化 在一小块滤纸上滴一滴 0.5% 的 Gly 溶液 → 风干 → 在原处滴一滴 0.1% 的茚三酮-乙醇溶液 → 将滤纸在微火旁烘干 → 观察颜色变化 40 头发少许 3 解释 现象 待个试管出现黄色后，在室温下逐滴加入10% NaOH 溶液至碱性，观察颜色变化 . 4 4 4 40 2 浓硝酸(滴) 0.3% Tyr 4 滴 0.3% Trp 4 滴 0.5% 苯酚4 滴 指甲少许 鸡蛋清溶液 4 滴 材料(滴) 6 5 4 2 1 管号 黄色反应 解释 现象 5 5 考马斯亮蓝染液?(ml) 0.9 1 蒸馏水(ml) 0.1 0 蛋白质溶液?(ml) 2 1 管号 试剂 考马斯亮蓝 * * *