BMSCs与软骨细胞共培养复合BMG修复关节软骨缺损的实验研究.pdfVIP

文 ／张 寿 陈 波 金旭红 刘亦恒 王琮仁 范忠诚 (中南大学湘雅海口医院骨科 中心，海南 海 口 570205) 摘 要 ：本文探讨BMSCs与同种异体肋软骨细胞共 之一。本试验将骨髓间充质干细胞与肋软骨细胞共培养 培养及复合 自体 “双相”骨基质 明胶 (BMG)修复关节 作为种子细胞，与 自体BMG复合修复兔膝关节软骨缺 软骨缺损的可行性。①获取两种细胞的P2代随机分为三 损，并对其修复效果进行评价。 组 ：共培养组、高浓度软骨细胞组，低浓度软骨细胞组， 1 材料与方法 体外培 养2周后检测各组GAG含量。②改 良的Urist法 制备 自体 “双相”BMG支架，并与共培养细胞体外培养 1．1材料 5天。⑤制备 56只兔膝关节软骨缺损模型，随机分为5 新西兰家兔 36只，普通级，体重 1．4～ 1．5kg， 组。实验组植入共培养细胞 -BMG复合体 ，对照组植入 购于长沙市天勤生物技术有 限公司。DMEM培养基 单纯BMG支架，空白组不作特殊处理。术后 1、2、5个 (Gibco)，南美洲胎牛血清 (FBS)(海克隆)，CO，细胞 月取材行大体 、组织学观察和改良的Pineda法评分。结果 ： 培养箱 (Thermo)，胶原酶 (Sigma)，1，9一二 甲基亚甲 ① 2周后 A组培养液的GAG含量 明显多于B、c组，差 蓝试剂盒 (Sotarbio)，倒置相差显微镜 (OlympusIX71)， 异有统计学意义 (尸0．o5)。② 电镜示 “双相”BMG呈 扫描电子显微镜 (13本电子公司)，二抗免疫组化试剂盒 多孔 网络状结构，细胞黏 附其表面，生长 良好。③术后 (Solarbio)，l1型胶原单克隆抗体 (博奥森)。 j个 月实验组软骨缺损 由透明软骨修 复，对照组和 空白 1．2方法 组仅由部分纤维组织填充。实验组各时期的评分优于对 1．2．1BMSCs与肋软细胞的分离、培养 照组和空白组，差异均有统计学意义 (尸0．05)。结论 ： (1)取 2～3个月的新西兰家兔，抽取骨髓 2～4ml， ①BMSCs与同种异体肋软骨细胞共培养，可被诱导分化 贴壁离心法获取BMSCs，15％FBS的H-DMEM培养 为软骨细胞，减少 了软骨细胞 的用量 ；②共培养细胞与 液重悬细胞后接种于培养瓶中于含 5％CO，，37℃的培养 自体 “双相”BMG复合可有效地修复关节软骨缺损 。 箱中孵育。细胞融合铺满瓶底 80％～90％，以1：2的 关键词 ：软骨缺损 ；组织工程 ；BMSCs；软骨细胞 ； 比例传代。取第二代BMSCs备用。 共培 养 (2)采用酶消化法先后用 0．25％胰蛋白酶和 0．2％II D01：10．5772／J．issn．1OO9—5659．2O15．16．020 型胶原酶消化肋软骨，然后洗涤，离心，10％FBS的 H-DMEM重悬细胞后接种于含 5％CO，37~C的培养箱 由于关节软骨无血管、神经及淋巴管，其营养主要 中孵育。传代方法同上。取P2肋软骨细胞备用。 来 自关节液，因此一旦损伤，很难 以自我修复…。近年 1．2．2BMSCs和软骨细胞混合共培养 来，新兴的软骨组织工程为软骨缺损的修复提供了新的 取第二代BMSCs和肋软骨细胞，浓度调整为3X 策略。选择安全、可靠、有效的种子细胞是其关键步骤 10／ml，随机分为三组：BMSCs与软骨细胞体积比为2：1， 骨组织特异微环境对BMSCs向软骨的定向分化起着重 软骨及软骨下骨结合更好。这可能是新生组织需要在局 要的促进作用 15]。Murphy JM等 将 自体间充质干细 部机械应力的作用下发生改建和重朔 I121，如术后让实验 胞植入半月板和前交叉韧带已全部切除的术山羊关节 动物膝关节 自由活动。另外单纯BMG支