过氧化氢酶及过氧化物酶作用.docVIP

动物生物化学实验指导 一、内容简介 动物生物化学是一门课堂理论与实验技术相结合的专业基础课。实验主要以生物大分子制备的一般过程以及电泳和层析等生物化学技术为主，采用经典和现代分析技术相结合的实验方法和手段进行设计，实验内容既包含生物化学研究技术的基本方法，又反映生物化学研究技术的发展水平。 开设实验为24学时，共有12 个实验可供选择，其中验证性实验4个，综合设计实验8个。由三部分所组成： 1．酶的性质及活力测定； 2．蛋白质的分离、纯化、鉴定及含量测定； 3．DNA的提取、分离及含量测定 二、实验教学目标与基本要求 通过本课程学习，使学生掌握常用的动物生物化学分析与制备技术，理解其基础理论，从而使学生增强对动物生物化学理论的感性认识，掌握有关生物科学研究的基本技术，并提高学生的动手能力。 三、实验项目与学时分配 序 号 实验项目 学时 备注 验 证 性 实 验 1 唾液淀粉酶活性的观察 3 ? 任选二? 2 琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制的观察 3 3 转氨酶的活性测定 3 4 脂肪酸的?-氧化——酮体测定法 3 综合设计实验Ⅰ 5 血清IgG的分离制备——盐析法 3 ? ? ?任选四 ? ? 6 凝胶层析法脱盐和分离蛋白质 3 7 DEAE-离子交换剂纯化血清IgG 3 8 聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定IgG纯度 3 9 紫外吸收法测定蛋白质含量 2 综合设计实验Ⅱ 10 动物组织中DNA的制备 3 ? ? ? 11 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 2 12 紫外吸收法测定DNA含量 2 ? 四、实验内容 实验1 唾液淀粉酶活性的观察 （一）原理 酶是指化学本质为蛋白质的生物催化剂。在一定条件下，酶促化学反应进行的能力即称为酶活性（酶活力）。影响酶活性的因素是多方面的，如温度、PH及某些化学物质等都会影响酶的催化活性。在一定条件下，能使酶活性达到最高时的温度即酶的最适温度，而能使酶活性达到最高时的PH即酶的最适PH。例如，唾液淀粉酶的最适温度是37℃，而其最适PH是6.8。能增高酶活性的物质称为酶的激活剂，能降低酶活性却又不使酶变性的物质叫酶的抑制剂。凡能使蛋白质变性的因素都可以使酶变性而丧失活性。 酶活性通常是通过测定酶促化学反应的底物或产物量的变化来进行观察的。 本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受理化因素影响的情况。唾液中含有唾液淀粉酶。淀粉在该酶的催化作用下会随着时间的延长而出现不同程度的水解，从而得到各种糊精乃至麦芽糖、少量葡萄糖等水解产物。而碘液能指示淀粉的水解程度——淀粉遇碘可呈紫色、暗褐色与红色，而麦芽糖与葡萄糖遇碘则不呈颜色反应，如图所示： 淀粉 糊精 麦芽糖+少量葡萄糖 （二）试剂及器材： （1）0.5%（W/V）淀粉溶液：称取0.5g可溶性淀粉，加少量预冷的蒸馏水，在研钵中调成糊状，再徐徐倒入约90ml沸水，同时不断搅拌，最后加水定容为100ml即成。要求新鲜配制。 （2）稀碘溶液：称取1.2g I2、2g KI，加少量蒸馏水溶解后，再加蒸馏水至200ml。保存于棕色瓶中，用前5倍稀释。 （3）不同PH溶液： A液—0.2mol/L Na2HPO4溶液：称取35.62g Na2HPO4·12H2O，将之溶于蒸馏水后定容至1000ml。 B—0.1mol/L柠檬酸溶液：称取19.212g无水柠檬酸，将之溶于蒸馏水后定容至1000ml。 ①PH5.0缓冲液——取A液10.3ml、B液9.7ml混合而成。 ②PH6.8缓冲液——取A液14.55ml、B液5.45ml混合而成。 ③PH8.0缓冲液——取A液19.45ml、B液0.55ml混合而成。 （4）0.5%（w/v）蔗糖溶液：称取蔗糖0.5g，将之溶于蒸馏水后定容至100ml。 （5）斑氏试剂： A液—称取无水CuSO417.4g，将之溶于100ml预热的蒸馏水中，冷却后用蒸馏水稀释至150ml。 B液—称取柠檬酸钠173g、Na2CO3100g，再加蒸馏水600ml，加热溶解后冷却，用蒸馏水稀释至850ml。 将A液与B液混合即得斑氏试剂。 （6）1%（w/v）NaCl溶液：称取NaCl 1g，将之溶解后用蒸馏水稀释至100ml。 （7）1%（w/v）CuSO4溶液：称取无水CuSO4 1g，将之溶解后用蒸馏水稀释至100ml。 （8）白瓷板（或比色板）、恒温水浴锅、电炉 （三）操作 1．唾液淀粉酶应用液的制备 （1）每人取一个干净的饮水杯，装上蒸馏水。 （2）先用蒸馏水漱口，将口腔内的食物残渣清除干净。 （3）口含约20ml蒸馏水，做咀嚼动作1~2min，以分泌较多的唾液。然后将口腔中的唾液吐入一个干