恶性疟原虫海南株var2csa基因的克隆、表达及免疫识别研究.pdfVIP

热带医学杂志 年 月第 卷第 期, . , . . 基础研究论著? 恶性疟原虫海南株 基因的克隆、表达及 免疫识别研究 康巍,彭帅,陆慧君,尹继刚,陈启军,姜宁 吉林大学人兽共患病研究教育部重点实验室,吉林长春 摘要:目的 克隆、表达恶性疟原虫海南株 基因 、 、 区,通过方法比较其与硫酸 软骨素 的亲和能力差异,以及人体对恶性疟原虫海南株 、不同区的免疫应答差 异。方法 根据区序列设计 对引物,扩增目的片段,并与 一 克隆载体连接。经、酶切、测序 鉴定正确后克隆至表达载体一 ,通过转化、诱导、纯化表达重组蛋白质, ? 和检测。通过 方法进行重组蛋白质与 的粘附实验以及与患者血清的免疫识别实验。结果 酶切及测序结果均表明 表达载体构建成功,表达并纯化 个区重组蛋白质,分子量与预计大小相同, 检测目的蛋白质具有 免疫反应性,显示不同蛋白浓度条件下 区均明显比其它两个区有更高的 值,并且 区被 妊娠相关疟疾病人血清识别水平显著高。结论基因 个区重组蛋白质表达成功, 区与 的粘 附能力较强,人体对 区的免疫应答反应可能在抗病免疫过程中起到关键作用。 关键词:妊娠相关疟疾;恶性疟原虫; 基因;;硫酸软骨素 中图分类号:. 文献标识码: 文章编号: ? ., , ,, , , ,, , , , , ,: / /,? . 一 , . 一 ,. .? :. ?. , . . ...,.. : ;; ;; 在疟疾流行地区,孕妇是感染疟疾的高危人群。 以南非洲每年有 万出生体重低患儿,有 万 在撒哈拉以南非洲地区,妊娠相关疟疾 孕妇处在疟疾的威胁下,造成大约 ~例 , 已经成为疫源地最为严重的 婴儿死亡 。在我国疟疾也仍然严重危害人民健康, 公共卫生安全问题 。会对母体和胎儿造成严重 云南、海南两省仍是我国恶性疟疾流行的主要地区, 伤害,如母体贫血、早产和婴儿出生体重低,撒哈拉 中部省份的疫情亦有所抬头 。妊娠期间虫体感染 红细胞 , 在胎盘的 大量聚集是导致该病发病的主要原因。这一聚集现 基金项目:国家重点基础研究发展计划 计划象是由一种独特的恶性疟原虫红细胞表面抗原 作者简介:康巍 一 ,男,硕士研究生,主要从事分子寄生虫学, 研究 通讯作者:姜宁,副教授.:. .与胎盘受体硫酸软骨素 ‘ ‘ 热带医学杂志 年 月第 卷第 期, . , . ., 的粘附介导的。研究发现,这一独特的基因中的、 和 区设计蛋白的编码基因是 ,属于基因 引物。三对引物分别为区上游引物: ’ 家族成员。 是一个的高分子量蛋白 ’,下游弓物: ’ 质,包含有 个区 。高水平的抗 抗体 ’: 区 与的保护性免疫有关 至此.基于 上游弓物: ’ 用于疫苗的研究。来保护疟疾流行地区的孕妇是可行 ’。下游弓【物: ’ 的。但在目前的技术条件下表达如此之大的一个蛋’; 区上游引物: ’白质是十分困难的,而且目前研究发现. ’,下游引物: ’ 的若干区都可以与 发生粘附或其产生的’。 中区、 区 抗体能够抑制虫体的粘附 。因此,鉴定出哪一个 引物 ’端均包含 酶切位点, ’端均包含 区在粘附过程中发挥主要作用以及人体对哪一 酶切位点, 区引物 ’端均包含 酶 个功能区的免疫应答反应在抗病免疫上起到关键作 切位点, ’端均包含 酶切位点。上述 对引物 用十分重要。本研究前期实验已经获得了恶性疟原虫 均由上海生工公司合成 海南株 基因/ / 区重组蛋白 . 目的基因的克隆 以恶性疟原虫海南株基因 质并通过 进行了粘附实验,本实验将克隆、 组为模板,分别用 组引物扩增 个 表达恶性疟原虫海南株 基因重 区片段,反应体系为,其中模板组蛋白质并比较其粘附能力:并对人体对恶性疟/ ,上、下游引物各/ 、 原虫海南株 、 不同区抗病 、 聚合酶 / 、免疫过程的差异进行免疫识别研究。以期发现我国 混合物 / 、双蒸水。反应参数 海南株恶性疟原虫的重要功能分子.为疫苗和 为:; ℃ , ℃ , ℃, 分子诊断等方面的研究奠定基础。个循环; ℃。 %琼脂糖凝胶电泳分析产 物,回收目的片段。将 条目的片段分别与克隆载体 材料与方法 . 连接,反应总体系为 ,其中回 . 菌种、载体与基因组 本研究所用质粒、感 收产物 ,, 受态细菌以及恶性疟原虫海南株基因组均为本室 。反应条件为 水浴过夜。测序正确后,按设 保存。 计的相应酶切位点酶切、回收目的片段,与表达载体 . 主要试剂 聚合酶及其缓冲液、 一 连接,连接体系为 ,其中目的片段 . 、标记物、 内切酶、 ,.载体 . , 连接酶 内切酶、 内切酶、琼脂糖、和 连 / , 连接酶 。反应条