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* 8oxo-G是物理性切割位点 U是酶切位点 上机组 Solexa是一种基于边合成边测序技术(Sequencing-By-Synthesis，SBS)的新型测序方法。通过利用单分子阵列实现在小型芯片(Flow Cell)上进行PCR反应。由于新的可逆阻断技术可以实现每次只合成一个碱基，并标记荧光基团，再利用相应的激光激发荧光基团，捕获激发光，从而读取碱基信息。 CS负责将待测样品固定于检测芯片(Flow Cell)中并进行扩增。 GA负责对芯片内的基因片段进行边合成边测序反应(SBS)，同时收集碱基信息。 Single-Read Sequencing 单向测序 Paired-End Sequencing 双向测序 2.1 Single-Read Sequencing Single-Read Sequencing(SR, 单向测序)指只检测基因片段一端的序列信息。 接头 接头 互补接头 基因序列 将被打断成几百个碱基（或更短），并在两个末端加上接头(adapter)的基因片段按一定浓度进行稀释。 将基因片段固定在芯片(Flow Cell)上。由于芯片表面连接有一层单链引物(Primer)，经处理后的碱基片段与芯片上的引物进行互补连接，被“固定”在芯片上 。 引物扩增，以样品为亲本链，使芯片引物延长形成复制链。 剩下的复制链其一端“固定”在芯片上，另外一端随机和附近的另外一个引物互补，被“固定”住，形成“桥”(bridge) 。 形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在芯片表面进行扩增，形成双链。 双链经变性成单链，再次形成桥，并作为下一轮扩增的模板继续扩增反应 。 反复若干轮扩增，每个单分子得到了大量扩增，成为单克隆“DNA簇群”。 OH Flow Cell接头 diol P7 P5 diol diol 模板杂交 diol diol 延长 diol diol 变性 diol diol 1st cycle 变性 1st cycle 退火 diol diol 1st cycle 延长 diol diol diol diol 2nd cycle 变性 2nd cycle 退火 diol diol diol diol diol diol 2nd cycle 延长 n=35 总数 线性化 OH 用ddNTP (?) 阻断 Cluster 扩增完成 OH diol diol OH Primer 加测序引物 OH “DNA簇群”在Genome Analyzer综合分析仪上进行序列分析。通过SBS法，进行一次反应合成一个碱基，读取一个数据。 通过拍照的方法进行捕获数据。每反应一次拍照四次（A、C、G、T各一次）。 通过生物信息学方法对取得的序列信息进行拼接。 C T A G C T A 5’- 3’- …-5’ G T 合成第一个碱基 Cycle 1:按顺序加入反应试剂 清除未反应的碱基和试剂 激发碱基荧光并收集荧光信号 去除阻断基团和荧光基团 Cycle 2-n: 重复前面的步骤 G T C T A G T C T G C T A G A 1 2 3 7 8 9 4 5 6 T T T T T T T G T … T G C T A C G A T … 2.2 Paired-End Sequencing Paired-End Sequencing (PE, 双向测序)是指检测基因片段的两端序列信息。 Single Read Paired End Template Hybridization 模板杂交 U U OH OH Grafted flowcell 芯片上的接头 U P7 P5 Initial extension 第一链的延长 U U Denaturation 变性 U U 1st cycle denaturation 变性 n=35 total U U 1st cycle annealing 退火 U U 1st cycle extension 延长 U U 2nd cycle denaturation 再变性 U U 2nd cycle annealing 退火 U U U 2nd cycle extension 延长 U U U Cluster Amplification 扩增后的簇 U U P5 Linearization (USER) 线性化 Block with ddNTPs 阻断 Primer 加测序引物 SBS 进行测序 Sequencing First R