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第 五 章 分子生物学研究法 本章主要内容 一、 重组DNA技术发展史上的重大事件 二、 基因操作的主要技术原理 三、基因克隆的载体系统 四、基因的分离与鉴定 一、 重组DNA技术发展史上的重大事件 1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； 2.50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题； 3.50年代末至60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。 重组DNA技术历史上的主要事件 （教材P148表） 基因工程的主要内容或步骤: 　　1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。　　2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。　　3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。　　4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。　　5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。 二、 基因操作的主要技术原理 序：传统的方法－－同位素标记、放射自显影技术的应用。 1． 核酸的凝胶电泳 ??? (1)基本原理：将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。 ??? 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。 （2）琼脂糖凝胶电泳 　　琼脂糖：红色海藻产物提取的多糖聚合物，经化学修饰的低溶点琼脂糖结构脆弱，低温下易熔化。 　　凝胶的分辨能力与凝胶的类型和浓度有关。凝胶浓度与凝胶介质孔隙大小呈反比，与分辨力呈正比。 在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）染色（ EB 能插入到DNA或RNA分子相邻碱基之间并在300nm波长紫外光下发出荧光）。此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。 （3）脉冲电场凝胶电泳（PFGE） 在脉冲电场中，DNA分子的迁移方向随着电场方向的周期性变化而改变。 在标准PFGE中，第一个脉冲电场的方向与DNA移动方向成45度角，而第二个脉冲电场的方向与DNA移动方向在另一侧成45度角。（P155图） PFGE技术用于分离大分子量的DNA。对于较大分子的DNA，常用更多的脉冲次数来更换其构型和方位以分离之。 2． 核酸的分子杂交技术 ??? 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳 分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地吸印 转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）等。 核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：?? 将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和噬菌斑印迹法?? 将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。 3． 细菌的转化 ???　　 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。??? 对绝大多数hsdR-，hsdM-突变体菌株（k12），每ug DNA可得107-108个转化子。 4、分子克隆技术 （1）高质量mRNA的制备 ?? 应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分离Poly(A)RNA。将dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的吸附物，用磁场吸附与PMP相连的Oligo(dT)-mRNA。 （2） 反转录成cDNA 可同时在反转录系统中加入Oligo（dT）12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA；应选用活性较高的反转录酶 应选用甲基化dCTP；应保证所获得双链cDNA的方向性。 5、PCR技术