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散射法测定生物大分子的应用研究 学生: 赵美丽 刘艳华 指导教师 于京华 曹伟 陈艳晶 摘要： 本文对光散射法的应用以及生物大分子目前的分析方法进行综述总结，并对共振 瑞利散射法和二级散射法的方法和应用进行简单介绍，展望对二级散射法的应用前景。 关键词： 共振瑞利；二级散射法；生物大分子 蛋白质、核酸是生物体内非常重要的两类生物大分子。蛋白质是生物最基本最重要的组 成成分之一，在生命的起源进化以及维持生物体正常的生命活动中都起着关键的作用。对蛋 白质实现定量测定对于解释蛋白质的结构与功能的关系，研究蛋白质与药物的相互作用机理 具有重要的意义。核酸是存在于一切生物体中的一类最重要的生物大分子之一，是生命体的 最基本物质，携带生物体的所有遗传信息，具有指导蛋白质的合成并控制有机体细胞的功能， 与生物体的生命活动和各种代谢有密切关系。目前核酸的分析研究已经成为分子生物学、生 命科学等学科中研究最为活跃的领域之一。研究核酸与小分子的相互作用，对开发新药物、 探寻核酸与药物分子的结合行为和作用原理以及在基因水平上实现对疾病的治疗具有很强 的指导意义。 随着科学技术的迅速发展，生物化学、临床医学、食品检验和化学研究等诸多领域对于 生物大分子研究越来越深入，而生物大分子的定量测定是其研究的基础，因此寻找更高灵敏 度、更高选择性、快速简便的测定生物大分子的方法对于推动各学科的相互发展具有重要的 意义。通常蛋白质的分析方法有吸光光度法[1] [2] [3] 、荧光法 、凯氏定蛋法 、紫外吸收法、高 效液相色谱法、毛细管电泳法、考马斯亮蓝染色法[4]等。吸光光度法测定一般选择性不高， 检测限低。荧光分析法由于较好的选择性和灵敏度近些年来应用较多，但是大部分物质本身 不会发射荧光，环境因素如温度、酸度、溶解氧以及污染物对荧光分析的影响也极为敏感， 限制了其进一步的应用。凯氏定蛋法适用范围广，结果可靠，但是操作繁琐，仪器贵重，对 于含有大量碱性氨基酸的蛋白质测定常常存在一定的误差。紫外吸收法简便、快速，但是样 品中含有易吸收紫外光的物质如嘧啶、嘌呤等常引起较大的偏差。高效液相色谱法、毛细管 电泳法灵敏度高，可以用于蛋白质的分离和测定，但投资大，限制了其广泛应用。考马斯亮 蓝法是目前最广泛的用于测定微量蛋白质的方法，该方法灵敏度高，分析快速，但是CBB 与蛋白结合形成的蓝色复合物，随反应时间延长，易发生沉淀反应[5] 。目前对于核酸的测定 方法通常有吸光光度法[6~8]、荧光分析法[9~11]、紫外光度法[12]、化学发光法[13~14] 。其中吸光 光度法和紫外光度法操作简便快速，目前仍被广泛使用，但是灵敏度不高，并且在测定核酸 的260 nm处有很多物质有吸收，干扰测定。荧光光度法应用广泛、灵敏度和选择性也较高， 但是试剂一般比较昂贵，部分带有一定的毒性，对研究人员的身体具有一定程度的危害。化 1 学发光法则常因耗时、背景干扰大的缺点而限制了其应用。 自从Pasternack等[15]首次通过共振瑞利散射（Resonance Rayleigh Scattering ，RRS ）技术 研究核酸大分子在卟啉化合物上的J型堆积以来，共振瑞利散射技术以其具有灵敏度高、操 作简便、选择性好的特点而广泛用于蛋白质、核酸等生物大分子在有机染料上的堆积、组装 的研究以及痕量及超痕量的测定，成为研究生物大分子的一种有力方法。通过分析研究荧光 光谱的变化发现，蛋白质、核酸等生物大分子可以通过静电引力、氢键、范德华力以及疏水 作用力在有机染料大分子上堆积、聚集，而生物大分子在染料上的堆积聚集的结果使得共振 瑞利散射的信号强度增强，并且其信号的增强与生物大分子的浓度在一定的范围内呈现良好 的线型关系，从而实现生物大分子的定量测定。 近些年来，利用二级散射（Second-Order Scattering ，SOS ）和反二级散射（Anti Second-Order Scattering，ASOS ）测定蛋白质的研究也渐渐引起了分析共作者的注意。二级