抗菌药微生物学筛选法.pptVIP

2006.08.15. 抗菌药物残留微生物学筛选法 内 容 提 要 引 言 微生物抑制法 国外研究使用状况 国内研究使用状况 引 言 抗菌药物残留及危害 抗菌药物是使用的品种最多、数量最大、用途最广、滥用现象最为严重的一大类药物 除急、慢性毒性作用外，人体消化道微生态的副作用是当前关注的热点问题之一 抗菌药物残留一直是国内外关注的重点 抗菌药物残留检测方法 快速筛选＋定量检测 快速筛选方法：色谱，光谱， ELISA，微生物 定量方法： 色谱，色-质联用，微生物 确证方法： 色谱，色-质联用 微生物抑制法（MIT） MIT 的 原 理 抗菌药物的特点 结构及理化性质不同，但抗菌作用相同 MIT的原理 抗菌药物对细菌的生理机能或代谢的抑制、阻断作用 几类MIT法 拭子法 试管法 微孔板法 拭 子 法 试 管 法 MIT 的 特 点 多残留法 β-内酰胺类，氨基苷类，四环素类，大环内酯类，氟喹诺酮类，林可胺类；磺胺类 现场检测 实验室，屠宰场，养殖场 适于多种基质 可食性组织，尿液，奶 简便，快速，高通量 价廉 可靠 MIT法研究内容 菌种筛选 培养基筛选 最低检测限试验 量-反应关系研究 回收率试验 假阳性与假阴性 试剂盒组装 稳定性与保质期 质量与质量标准 复核试验 MIT法的技术难点 满足普筛要求的细菌 嗜热脂肪芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，腊样芽孢杆菌，嗜热链球菌，大肠杆菌等 满足各类（种）药物残留限量要求的培养基 营养成分，颜色指示剂（酸碱，氧化还原），特殊物质（增加选择性） 强壮性与保质期 除菌种和培养基外，抗菌药物种类、被检基质、培养温度和时间等有影响 国外研究使用概况 几种试剂盒检测条件比较 几种试剂盒最低检测限比较(mg/kg) 几种试剂盒经济性比较 美国：Charm AIM-96，Charm Farm Test Minivial， Charm Farm Test Vial 德国：Brilliant Black Reduction Test 荷兰：Delvotest P，Delvotest SP，Delvotest cow test， Delvotest MCS 意大利：Copan Milk Test 芬兰：Valio T101 现有方法检测条件比较 现有方法的检测限量比较 μg/L 国内研究使用情况 本实验室研制的部分残留快速检测试剂盒 FAST法最低检测限(μg/g或mL) STOP法最低检测限(μg/g或mL) LAST法最低检测限(μg/mL) 菌液稳定性试验 新霉素纸片稳定性试验 STOP和LAST培养基稳定性 与国外同类产品比较（μg/g） 牛奶中青霉素类的最低检测限 假阴性率试验 假阳性率试验 微生物法与HPLC法比较 与国外试剂盒比较最低检测限 与国外试剂盒比较盲样分析 动物残留试验 磺胺类残留检测方法研究 磺胺类是畜禽、水产养殖业中常用的抗生素；其残留能具有致癌性，引进过敏反应，耐药性增加等； 1999年欧盟禁止使用磺胺类抗球虫药；2002年美国禁止食品动物中使用；随后，日本禁止在家禽中使用；2005，中国将磺胺类列为残留重点监控对象。 磺胺类抗菌活性低。美国的FAST、STOP、CAST、Charm，欧洲的荷兰新肾法、欧洲四平皿法、英国十二平皿法、德国三平皿法，日本的四平皿法都对磺胺类的检测效果差。 国外几种试剂盒比较 最低检测限（ μg/g或μg/mL） 与HPLC法比较 动物残留试验 室温储存培养基的稳定性 2～8℃储存培养基的稳定性 储存8个月，新霉素纸片的抑菌圈直径均在21.6-23mm,复合要求。所以新霉素纸片有效期至少为8个月以上。 贮存不同时间的新霉素纸片,在新制备的STOP培养基及菌液上试验，观察抑菌圈的变化,考察失效期 每法的培养基铺在平皿内，6皿1包，封装于塑料袋中，常温储存。每周观察感观变化，每月拿出1包，观察新制备STOP菌液生长情况和新霉素纸片的抑菌情况。 STOP/LAST培养基保质期为6个月。 FAST培养基保质期为6个月。 FAST培养基稳定性试验 10 30 苯唑青霉素 5 30 青霉素V 10 30 乙氧萘青霉素 3 4 阿莫西林 20 30 双氯青霉素 3 4 氨苄青霉素 2 4 青霉素 牛奶（μg/L) MRL（μg/L) 药 物 30 30 30 30 4 4 4 添加浓度 (μg/L）