家蚕BmAGO1基因的克隆、表达分析及其结合RNA的分离与鉴定.docVIP

 家蚕 BmAGO1 基因的克隆、表达分析及其 结合 RNA 的分离与鉴定# 高珍1,2，洪叶挺1,2，周芳1,2，陈健1,2，吕正兵1,2，张耀洲1,2，聂作明1,2** 5 10 15 20 25 30 35 40 （1. 浙江理工大学生命科学学院生物化学研究所，杭州 310018； 2. 浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室，杭州，310018） 摘要： RNA 诱导的沉默复合体（ RNA-induced silencing complex， RISC）是一种包含 Argonaute(AGO)等蛋白的核糖核蛋白复合物，其能结合成熟 microRNA（miRNA），介导 mRNA 靶标基因的转录后基因沉默或降解，从而参与基因的表达调控。AGO 家族蛋白是 RISC 复合体的核心，是 miRNA 功能途径中的关键蛋白，其能够结合 miRNA 以及剪切靶标 基因，在生物的生长发育过程起重要的作用。同时，利用 AGO 蛋白抗体免疫沉淀分离其结 合 RNA 是目前规模化分离鉴定 miRNA 靶基因的主要方法，其研究已经备受关注。本研究 通过对家蚕 cDNA 文库的筛选获得了一个编码 Argonaute1 蛋白的 cDNA 序列，命名为 BmAGO1，并确定其抗原表位区 Kago-1，构建重组表达质粒 pET-28a(+)-Kago-1，然后在大 肠杆菌 BL21（DE3）中表达并利用纯化的重组蛋白免疫新西兰兔获得抗体。Western blotting 检测该基因在家蚕不同发育时期和不同组织的表达水平，结果显示发育时期中蛹期表达量最 高，组织中头和皮表达量最高。由于 AGO 蛋白为 miRNA 功能途径的关键蛋白，上述表达 谱分析表明家蚕蛹期与五龄幼虫的头和皮组织中的基因表达可能存在较为活跃的 miRNA 调 控。因此提取头和皮组织总蛋白，用制备的多抗免疫共沉淀得到 RNA/BmAGO1 蛋白复合物， Trizol 法提取得到结合 RNA，以家蚕潜在 miRNA 靶基因 BmEm4、Bm(spl)-like 和 BmEmc 为测试基因，经过荧光定量 PCR 鉴定发现，和提取的组织总 RNA 相比，BmEm4、Bm(spl)-like 和 BmEmc 基因在家蚕 BmAGO1 结合 RNA 中的富集倍数分别为 3.52 倍、1.56 倍和 0.75 倍。 其中前期研究显示，BmEm4 基因的 3’UTR 存在保守的 miR-7 和 miR-79 结合位点，这进一 步证实了 BmEm4 为 miRNA 调控靶基因。目前还没有家蚕 miRNA 靶基因鉴定的相关工作， BmAGO1 结合 RNA 的有效分离为家蚕 miRNA 靶基因的规模化鉴定打下基础。 关键词：分子生物学；家蚕；BmAGO 1 基因；表达谱分析；免疫共沉淀；结合 RNA 中图分类号：Q71 Molecular cloning, Expression profiling of BmAGO1 gene in silkworm and the identification of its binding RNA GaoZhen1,2, Hong Yeting1,2, Zhou Fang1,2, Chen Jian1,2, Lv Zhengbing1,2, Zhang Yaozhou1,2, Nie Zuoming1,2 (1. Institute of Biochemistry, College of Life Science,Zhejiang Sci-tech University,HangZhou,310018; 2. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Silkworm Bioreactor and Biomedicine, HangZhou 310018) Abstract: RNA-induced silencing complex (RISC) is a ribonucleoprotein complex, which contains Argonaute (AGO) protein. RISC can bind mature microRNA (miRNA) and mRNA of its target gene, resulting in gene silence or degradation in post-transcriptional level, and thus participate in regulation of gene expression. AGO family proteins are the core of RISC complex and the key protein of fu