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第八章动物基因工程 第一节 动物基因工程的发展状况与趋势 动物基因工程的实质是改变动物的遗传组成，增加动物的遗传多样性，赋予转基因动物新的表型特征，使能够更好地服务与人类社会。 从转基因的技术手段来看，除DNA显微注射法外，人们先后试过反转录病毒载体介导法、精子介导法、胚胎干细胞介导法和核移植法等多种转基因方法。 转基因细胞的核移植技术已经成为转基因动物生产的主流方法。 转基因在基因组中的存在方式有两种，即随机整合和定点整合。 为了达到外源基因的高效表达，在转基因结构上增加了含有位点控制区（LCR）、核基质附着区(MAR)等调控元件，可以实现插入位点非依赖性、拷贝数相关的表达模式。LCR和MAR的功能不受种属差异的限制，无论外源基因插入什么位点，都能够维持一个开放的染色体结构，有利于基因的表达。 基因打靶技术的出现与发展，实现了对目的基因的定位操作。 ３、从传统转基因到条件控制的转变 从转基因的策略来看，动物转基因技术的发展经历了两个阶段：第一阶段为传统转基因动物阶段，第二阶段为条件性转基因动物阶段。 借助转基因技术可将单一的功能基因和基因簇引入高等动物的基因组，或将目的基因从动物基因组中敲除，实现了种系内和种系间基因转移或修饰，产生新的基因型和表型。 目前转基因动物主要应用在生物学基础研究、医学疾病模型、动物生物反应器、异种器官移植、动物遗传改良等５个方面。 第二节 转基因动物技术 一、动物基因工程载体 二、基因转移技术 一、动物基因工程载体 作为动物基因工程载体必须具备以下几个功能： 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力 为外源基因提供在受体细胞内复制或整合的能力 为外源基因提供在受体细胞内的扩增和表达能力 载体可分为: 质粒型表达载体 病毒载体 定向打靶载体 1 .质粒型表达载体 表达载体的共同特点是都带有原核复制区和选择性标记基因，保证重组DNA分子能够在大肠杆菌中扩增，同时也必须包括能在真核细胞表达的相关组件。一般包括转录外源DNA序列的启动元件、转录产物有效地加上poly（A）尾巴所必需的信号序列、真核细胞中的选择性标记，另外还增加了一些附加元件，如增强子、内含子、剪接供体与受点，以保证外源基因的高效表达。 以山羊乳腺特性表达载体pBC1为例 2. 病毒载体 作为基因转移的病毒载体须具备以下基本条件： 携带外源基因并能够包装成病毒颗粒 介导外源基因的转移与表达 对机体不致病 （1）腺病毒（adenovirus） （2）腺相关病毒（ AAV） 腺相关病毒是一种天然复制缺陷型非致病性单链DNA病毒，其复制需要有辅助病毒的共转染。无共转染时，野生型AAV优先（70%）整合在人染色体的19q13.3位点处，潜伏存在直至被辅助病毒拯救出来。其整合需要基因组两端的ITR，以及非结构基因编码的蛋白Rep78 和Rep68的存在。 AAV具有以下几个方面特点： 非致病性、无免疫原性和无炎症反应 能感染静止期的细胞，如神经元细胞 插入的外源基因表达时间长，可达到1年之多 宿主范围广 热稳定性强，容易通过灭活辅助腺病毒纯化 （3）反转录病毒 反转录病毒是一种整合型单链RNA病毒，感染宿主细胞后，病毒颗粒中的pol基因表达出反转录酶，以单链的RNA基因组为模板，立即转录出一份线形双链DNA复本，然后在整合酶（Int）介导下，整合到宿主的基因组内，此时整和的病毒序列被称为前病毒。 反转录病毒基因组整合到宿主细胞基因组后，其DNA随宿主DNA的复制而复制，并由5`-LTR中的一个强启动子转录出病毒RNA链，它既是病毒基因组，同时又具有mRNA模板活性，翻译出结构蛋白和反转录酶。在宿主细胞质中，两条相同的RNA链和反转录酶被包装与内壳中，形成的成熟病毒颗粒以芽植方式分泌至细胞外，但通常不致死宿主细胞。 3 .定向打靶载体 基因打靶是通过外源基因与靶细胞染色体上的同源序列间的同源重组，将外源基因定点整合到靶细胞特定位置上，而使某一个特定位点上的基因发生定点突变的技术。 在细胞内存在两条相同的DNA链（同源染色体），在细胞内酶的作用下，可以将其切开，发生交叉，然后重新连接，从而发生DNA链的交换并引发重组。 （1）基因敲除 敲除型载体由两段与基因组内靶基因座序列同源的 DNA 片段（又称同源臂）组成，中间为正向选择标记，同缘臂外侧为真核细胞中的负选择标记及在原核细胞中进行复制与筛选的载体DNA序列。 （3）基因下调（knock-down） RNA干扰（RNAi）又被称为基因下调，通过干扰RNA（siRNA）分子的作用达到转录后基因沉默的效应。 siRNA的制备方法主