my实验九.docVIP

山 西 大 学 综 合 化 学 实 验 报 告 实验名称：溶胶—凝胶法固定α-淀粉酶及其活性测定 学 院 化学化工学院 学生姓名 周子竞，吴拥军 专 业 化学 学 号 2008296052 ， 2008296032 年 级 2008 指导教师 高春光 二○一一年三月二十五日 溶胶—凝胶法固定α-淀粉酶及其活性测定 实验学生：吴拥军，周子竞 山西大学，化学化工学院，山西 太原 030006 【摘要】固定化方法主要有物理包埋法、吸附法和共价交联法等。其中，物理包埋法具有实验条件温和、对生物活性单元失活作用小、不易泄漏即可固定高浓度的生物活性单元等优点，是迄今为止最为普遍的固定化技术。载体材料的物理和化学性质决定着固定化生物活性单元活力大小。本实验采用溶胶-凝胶材料正硅酸乙酯为硅原对α-淀粉酶进行包埋固定，研究包埋后酶的使用性能，使酶抗变性能提高。 【关键词】溶胶-凝胶法，α-淀粉酶，酶的固定化，酶活性的测定 【导言】 1 .固定化及其意义 本实验采用溶胶凝胶材料正硅酸乙酯为硅原对α-淀粉酶进行包埋固定，研究包埋后酶的使用性能，使酶抗变性能得到提高。溶胶凝胶是一种起源于约150年前的生产陶瓷材料的方法，它受到青睐是因为它提供了一种简单的途径来固定那些对热敏感的化学和生物分子。溶胶—凝胶过程包括两个步骤，一是烷氧基金属有机化合物（如等）的水解过程；二是水解后得到的羟基化合物的压缩及缩聚过程。 该法的优点有： （1）它在低温和温和的化学条件下形成，凝胶均匀、稳定、分散性好。 （2）能与许多无机试剂及有机试剂相溶，便于固定掺杂其他试剂。 （3）化学、光学、热学及机械稳定性好，适合在严酷条件下使用。 （4）光谱吸收一般在近紫外-近红外区域，有利于吸光或荧光测量。 （5）掺杂或未掺杂的溶胶凝胶可加工成各种形状，或形成块状或涂于硅、玻璃及光纤上形成敏感膜，也可根据特殊用途用于制成纤维或粉末材料。 2.酶的活性测定 淀粉遇碘显蓝色，不同量的淀粉和一定量的碘所显得颜色深浅不同，这就提供了一条测溶液中淀粉含量的方法：可见分光光度法，以一系列的不同量的淀粉溶液做一条淀粉量与吸光度的标准曲线，再测定未知溶液中淀粉量。通过测定与固定化酶颗粒反应后的淀粉的量，就可以求得水解的淀粉量从而计算出固定化酶的活性。 1.实验部分 1.1仪器与试剂 7200型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；PHS-2C精密pH酸度计；正硅酸乙酯；三羟甲基氨基甲烷；浓盐酸12M; α-淀粉酶(生物纯)；蒸馏水；可溶性淀粉；苯甲酸；磷酸氢二钠；考马斯亮兰G-250;95%乙醇溶液；牛血清蛋白（BSA）。 1.2酶的固定化 1.2.1 量取12.9ml正硅酸乙酯，至于50ml锥形瓶中，加入1.34ml水，搅拌5min后加入0.09mlHAc,保持持续搅拌。 100mlTris-HCl缓冲溶液的配制（pH=7.58） 配置25ml0.04M的tris溶液，配置70ml0.04MHCl(浓盐酸的浓度为12M)溶液，逐渐将0.04MHCl溶液加入到tris溶液中，边加边用酸度计测定pH,到pH=7.58后（约需HCl:20~30ml）时停止，加水定容到100ml. 1.2.3 称取0.4gα-淀粉酶（粗酶，具体浓度后面测定），用上述Tris-HCl缓冲溶液定容于10ml比色管，获得的粗酶浓度为：0.04g/ml。 1.2.4 取步骤3中的酶溶液5ml,加入到步骤1中的溶液中，保持持续搅拌，进行溶胶凝胶过程，约1~2周后获得固定化酶颗粒。 1.3工作曲线 1.3.1 淀粉溶液的配制（需当天配制）: 小烧杯中，加入0.4000g可溶性淀粉+0.86g苯甲酸+2.66g磷酸氢二钠+30ml水，加热溶解后，用水定容到100ml,该淀粉溶液的浓度为4mg/ml,为储备液。稀释10倍后，以0.4mg/ml浓度的溶液为工作液，进行淀粉工作曲线的测定。（在配制淀粉溶液的过程中，一定要等到淀粉溶液完全冷却后在定容于100ml的容量瓶中） 1.3.2 0.1N碘储备液的配置 精确称量碘酸钾0.3567g,碘化钾4.5g,共置于100ml容量瓶中，加入水80ml,然后缓慢加入浓盐酸9ml,摇匀后用水定容。使用时稀释10倍，此0.01N的溶液为工作液。 1.3.3 考马斯亮兰溶液的制备 称取25mg考马斯亮兰G-250,r溶于12.5ml95%乙醇，再加入49%浓磷酸，加入至250ml,混合均匀，至于塑料瓶中，用后置于冰箱保存。 1.3.4 牛血清蛋白（BSA）标准溶液的配制 精确称取BSA0.01g,用配置好的tris-HCl缓冲溶液定容于10ml比色管，浓度为1mg/ml,作为储备液。使用时用tris-HCl溶液稀释10倍为