经典开题报告.pptVIP

研究背景 研究内容、研究目标及拟解决的关键问题 研究方法、手段、技术路线及可行性分析 统计学分析 课题创新之处 年度计划及预期进展 实验条件及经费预算 Hp在人群中感染率高，能引起多种严重疾病 机体免疫反应在Hp感染致病和Hp疫苗免疫保护中均起重要作用 研究Hp感染的免疫致病机制及Hp疫苗防治机制有重大意义 Tim-3是第一个被发现与T细胞反应有关的Tim家族成员 表达在成熟Th1细胞膜上 不表达在未成熟Th细胞、Th2细胞上 包含Ig-V样结构域的信号肽、粘附素样结构域、跨膜区域、细胞内尾巴 Tim-3激活后降低Th1反应 Galectin-9是Tim-3的配体，主要表达在CD4+的T细胞 Tim-3/Galectin -9通路的激活可导致Th1细胞效应功能的终止 我们前期研究发现 阻断Tim-3信号通路可增加TLR4、MyD88表达、激活NF-κB TLR信号的负性调控因子SIGIRR可上调Tim-3的表达 提示：Tim-3和TLR4信号通路可相互调控 我们的前期研究发现，阻断Tim-3信号通路后，Treg减少 说明Tim-3信号通路在调节Treg控制炎症反应中起重要作用 我们的研究还发现Tim-3阻断 提高Hp疫苗的免疫保护率，但并不降低Hp自然感染小鼠胃黏膜内Hp定植密度 加剧Hp疫苗接种小鼠和Hp感染小鼠胃黏膜炎症程度 提示Tim-3信号通路参与Hp感染的免疫致病和Hp疫苗的免疫保护作用 问题：Tim-3信号通路激活，将会对Hp感染和Hp疫苗免疫产生何种影响？目前尚不清楚 研究Tim-3信号通路激活对Hp感染和Hp疫苗接种小鼠Th1和Th2免疫反应、TLR4信号通路及Treg的影响，以及这些影响对Hp感染引起的的炎症反应和Hp疫苗免疫保护作用之间的关系 Hp感染和Hp疫苗接种小鼠给予Tim-3L，观察以下指标： 小鼠脾细胞中Tim-3阳性细胞数量的变化 胃黏膜局部Tim-3表达、 Treg和几个有代表性的Th1（IFN-γ、LI-12）和Th2（IL-4、IL-10）细胞因子含量的变化 胃黏膜局部TLR4信号通路的几个中间环节和下游分子（TLR4、MyD88、NF-κB）的变化。 胃黏膜内Hp感染、炎症程度情况 淋巴细胞对Hp刺激的增殖反应 Tim-3阳性细胞的数量 培养上清液中Th1和Th2细胞因子含量 CD4+效应T细胞中TLR4信号通路的几个中间环节和下游分子的变化 比较它们与未处理组的差异 阐明Tim-3信号通路激活对Hp感染和Hp疫苗接种小鼠Th1和Th2免疫反应、TLR4信号通路及Treg的影响，以及这些影响对Hp感染引起的的炎症反应和Hp疫苗免疫保护作用之间的关系 阐明Hp感染和疫苗接种后Tim-3/Tim-3L信号通路的变化及与疾病和疫苗保护机制的关系 明确通过对Tim-3/Tim-3L信号通路的调控可否减轻Hp相关性疾病的严重程度和提高疫苗的免疫保护作用 体内研究 未经处理组: ①Hp感染组②Hp疫苗组 ③对照组 Tim3配体处理组： ①Hp感染组②Hp疫苗组 ③对照组 体外研究 未经处理组： ① Hp刺激组②空白组 Tim3配体处理组： ① Hp刺激组②空白组 Hp标准菌株SS1接种于含7.5%无菌绵羊血的空肠弯曲菌选择性培养琼脂基础上，微需氧条件下（O2 5%、CO2 10%、N2 85%）37℃培养2-3天 Hp菌液行超声粉碎后，分别与霍乱毒素（CT）和壳聚糖构建以CT和壳聚糖为佐剂的Hp疫苗 6-8周龄的SPF级的BALB/C小鼠，给予含109/ml的SS1 Hp菌液，0.5ml/只灌胃，隔日1次，共5次。末次灌胃4周后，取10只小鼠处死，取胃黏膜进行病理检查和Hp培养，确定Hp感染模型的建立 6-8周龄的SPF级的BALB/C小鼠，每只小鼠给予0.5ml含5ugCT和1.2mg Hp抗原的PBS或0.5ml含壳聚糖微球-1.2mgHp抗原有效量的PBS，于第0、7、14、21天灌胃各免疫1次，免疫后4周给予109/ml的SS1 Hp菌液，0.5ml/只攻击小鼠，隔日1次，共4次。末次攻击后4周处死小鼠，取标本检测各项指标 在小鼠Hp接种和疫苗接种的第1周内，每天腹腔内注射100μg Galectin-9 用淋巴细胞分离液分离小鼠脾淋巴细胞，终浓度为500nM/ml的Galectin-9预处理2h ，按细胞与细菌比例：1:100、1:200、1:300浓度，共同孵育24-48（3、6、12、24、48）小时后，测细胞的增殖反应，并收集细胞和培养上清，测各项指标 采用Western blot法和免疫组化法检测胃黏膜内及培养细胞TLR4、MyD88、NF-κB和