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医学免疫学实验课程教案 （2007 ---2008 学年度 第一 学期） 教学内容：细胞免疫检测Ⅰ：细胞因子的检测（设计性实验）　 授课对象：2006级全体 教学时间及学时： 3学时 实验任务： 市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用，请设计一个方案证实之（从细胞因子的角度考虑）。 教学目的和要求： 一、初步掌握从细胞因子的角度证实某产品有免疫增强作用的实验设计。 二、了解五种标记技术的原理、特点和应用。 三、掌握ELISA的实验原理、操作方法及其临床实用意义。 教学重点和难点： 1、从细胞因子的角度证实某产品有免疫增强作用的实验设计。 2、ELISA的实验原理、操作方法。 教学方法： 1．注重学生综合、分析能力培养，调动学生学习的主观能动性。 2．启发式、互动式教学手段，强调学生的协作性和团体精神。 3、对学生严格把关，保证实验课的过程和结果。 思考题： 一、有哪些实验可以检测机体的细胞免疫功能？ 二、常见的免疫标记技术包括哪些？ 三、试述ELISA常用的三种方法都是什么，何种检测抗原、何种检测抗体。 参考书目： 1、《医学免疫学》（面向21世纪课程教材） 主编：龚非力 科学出版社 2004年版 2、医学微生物与免疫学实验指导，三峡大学医学院生物病原学部编。 3、医学免疫学实验指导，主编：张秋萍，武汉大学出版社。 教学内容及时间分配： 一、讨论设计方案 30分钟 二、总结方案及讲解五种免疫标记技术 　　　　15分钟 方案归纳： 1、人体免疫包括细胞免疫和体液免疫。本次实验从T细胞分泌的细胞因子着手检测细胞免疫功能。 2、确定研究对象，给药途径，剂量，样本量。给药后检测血清中细胞因子的含量。 3、因为体内细胞因子含量低，故选取免疫标记技术检测细胞因子的含量。 五种免疫标记技术： 1、 免疫荧光技术： 2、 放射免疫分析法： 3、 酶联免疫分析法 4、 化学发光免疫分析法 5、 金标记技术 三、酶联免疫吸附试验的原理及操作步骤（双抗体夹心法） 30分钟 原理： 1．抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； 2．抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； 3．酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 操作步骤 1．抗体包被 2．封闭：用10%小牛血清或奶粉0.1毫升封闭，37℃孵育20分钟，洗涤3次。 3．加待测标本 于每孔内分别加不同稀释度（如1：5，1：10，1：20…1：80）的待测血清，PBS空白对照，阴性对照血清，阳性对照血清各0.1毫升。37℃孵育30分钟，洗涤3次。 4．加酶标抗体 于每孔加酶标抗体各0.1毫升，37℃孵育1小时，洗涤3次。 5．加临时配制的底物溶液各0.1毫升，置暗处37℃孵育10分钟。加2M硫酸1滴终止反应,5分钟内检查结果。 6. 结果判断：肉眼观察: 7．用酶标仪检测： 四、酶联免疫吸附试验（操作）　　　　　　　　　　　　　 100分钟