多相法鉴定降解天然秸秆的功能菌.docVIP

【标题】多相法鉴定降解天然秸秆的功能菌 【作者】曹 桥 【关键词】功能菌　　PCR　　康宁木霉 【指导老师】王新惠 【专业】生物科学 【正文】1.引言1.1研究进展在生产生活中很多方面都会利用到功能菌，各种功能菌都有其不同的作用，为了人们能够有效率的使用功能菌需要对其进行分类和鉴定，虽然目的不同但两者是相互联系的，不能截然分开。在微生物分类发展的早期，主要的分类、鉴定指标局限于利用常规方法如鉴定微生物细胞的形态、构造和习性等表型特征水平上，这可称为经典的分类鉴定方法。随着分子生物技术的兴起，从1960年代起人们开始利用核酸分析、化学成分和数值分类法等对菌种的进行分类和鉴定。通常微生物的分类鉴定可分成4个不同水平[1，2]:①细胞的形态和习性水平；②细胞组分水平；③蛋白质水平；④核酸水平。首先对于细胞的形态和习性水平可用经典的研究方法，观察微生物的形态特征、运动性、酶反应、营养要求、生长条件、代谢特性、致病性、抗原性和生态学特征等；其次对于细胞组水平的鉴定包括细胞壁、脂类、醌类和光合色素等成分的分析，所用的技术除常规技术外，还使用红外光谱、气相色谱、高效液相色谱和质谱分析等新技术；再者对于蛋白质水平的鉴定包括氨基酸序列分析、凝胶电泳和各种免疫标记技术等；最后对于核酸水平，包括（G+C）mol%值的测定，核酸分子杂交，16SrRN或18SrRNA寡核苷酸序列分析，重要基因序列分析和全基因测序等。对于细胞的形态和习性水平首先观察到微生物的是荷兰人列文虎克（Antory Van Leeuwenhoek，1632～1723）。他于1676年用自磨镜片制造了世界上第一架显微镜（约放大40～270倍），并从雨水、池塘水等标本中第一次观察和描述了各种形态的微生物，为微生物的存在提供了有力证据，亦为微生物形态学的建立奠定了基础。在接下来的细胞组分以及蛋白质水平上俄国学者伊凡诺夫斯基（Nвановский）于1892年发现了第一种病毒即烟草花叶病病毒。1897年Loeffler和Frosch发现动物口蹄疫病毒。1901年美国学者Walter-Reed首先分离出对人类致病的黄热病毒。1915年英国学者Twort发现了细菌病毒（噬菌体）。进入现代微生物时期，由于生物化学、遗传学、细胞生物学、分子生物学等学科的发展，以及电子显微镜、气相、液相色谱技术、免疫学技术、单克隆抗体技术、分子生物学技术的进步，促进了微生物学的发展。1967～1971年美国植物病毒学家Diener等发现马铃薯纺锤形块茎病的原原是一种不具有蛋白质的RNa，分子量约为100,000，这类致病因子被称为类病毒?(Viroid)。随后在研究类病毒的过程中又发现一种引起苜蓿等植物病害的拟病毒(Virusoid)。1982年发现引起羊搔痒病的病原为一分子量27KD的蛋白，称朊病毒(Virino)。1983年有关国际会议上将这些病原因子统称为亚病毒(Subvirus)。传统的微生物鉴定方法只能大概鉴定微生物的大类，而不能进一步鉴定微生物的种属，通过近几十年微生物鉴定的发展，越来越多的高科技技术已经应用到微生物的鉴定中去，弥补了以前传统的形态鉴定的不足。在对各种细胞型微生物进行鉴定工作中，经典的表型指标很多，这些指标是微生物鉴定中最常用、最方便和最重要的数据，也是任何现代化的分类鉴定方法的基本依据，但是若应用常规的方法，对某一未知纯培养物进行鉴定，则不仅工作量十分浩大，而且对技术熟练要求也很高，所以出现了一系列对微生物进行快速、标准测定的鉴定仪器，由此，产生的全自动细菌鉴定仪就是为了更快速、准确的鉴定微生物。使用此全自动细菌鉴定仪可以大幅度提高工作效率，减少人工和消耗成本，最大限度减少实验误差，提高检验信息的准确性、稳定性和安全性，但是自动化鉴定系统是根据数据库中所提供的背景资料鉴定细菌，数据库资料的不完整将直接影响鉴定的准确性。1960年代起开始利用分子生物技术手段进行鉴定[3]，DNA是除少数RNA病毒以外的一切微生物的遗传信息载体。每一种微生物均有其自己特有的、稳定的DNA即基因组的成分和结构，不同种微生物间基因组序列的差异程度代表着它们之间亲缘关系的远近、疏密。核酸探针检测技术以核酸分子杂交技术为核心，利用探针分析DNA序列及片段长度的多态性。探针是能与特定核苷酸序列发生特异性结合的已知碱基序列的核酸片段。基因探针是一段与目的基因或DNA互补的特异核甘酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。目前基因探针技术主要有原位杂交、荧光原位杂交、斑点印迹、Southern blotting、Northern blotting等方法，对溶液、细胞组织内或固定在膜上的核甘酸序列进行检测。核酸分子杂交技术是