第二章工具酶第三章载体.ppt

质粒重要的大肠杆菌质粒载体pGEM-3Z：多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’用于外源基因的高效表达注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等第61页，共108页，星期日，2025年，2月5日质粒质粒DNA的分离纯化实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：氯化铯密度梯度离心法质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱溶法质粒DNA纯度底、快速、操作简便沸水浴法质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间第62页，共108页，星期日，2025年，2月5日质粒质粒DNA的分离纯化氯化铯密度梯度离心法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs第63页，共108页，星期日，2025年，2月5日质粒质粒DNA的分离纯化碱溶法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA用无DNase的RNase去除残余的RNAcccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA第64页，共108页，星期日，2025年，2月5日质粒质粒DNA的分离纯化沸水浴法：用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁沸水浴40秒钟离心，用无菌牙签挑去沉淀物乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA第65页，共108页，星期日，2025年，2月5日噬菌体或病毒DNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增第66页，共108页，星期日，2025年，2月5日噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体的生物学特性：生物结构l噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体l噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成l-DNA全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61个基因第67页，共108页，星期日，2025年，2月5日l噬菌体生物学特性：生物结构5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l-DNA第68页，共108页，星期日，2025年，2月5日噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体生物学特性：感染周期E.coli吸附LamB受体注入复制包装裂解第69页，共108页，星期日，2025年，2月5日噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体生物学特性：感染周期体内包装100个左右的拷贝包装范围为原DNA的75-105%即36-51kbDA第70页，共108页，星期日，2025年，2月5日噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体生物学特性：溶原状态l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶菌状态DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态第71页，共108页，星期日，2025年，2月5日噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时