第四章基因工程所需的基本条本.pptVIP

LB培养基配制1升培养基，应在950ml去离子水中加入：细菌培养基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)10g细菌培养基用酵母提取物(bacto-yeastextract)5gNaCl10g摇动容器直至溶质完全溶解，5mol/LNaOH(约0.2ml)调节pH值至7.0,加入去离子水至总体积为1L，15lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。第126页，共195页，星期日，2025年，2月5日溶液I50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)在10lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4℃。作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活第127页，共195页，星期日，2025年，2月5日溶液II0.2mol/LNaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释)1%SDS作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。第128页，共195页，星期日，2025年，2月5日溶液III5mol/L乙酸钾 冰乙酸 水 作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS使线性DNA、蛋白沉淀第129页，共195页，星期日，2025年，2月5日培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养12～16小时;取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100?l溶液1，充分混匀放置3-5分钟;加入200?l新配制的0.2mol/LNaOH+1％SDS（溶液II），加盖颠倒6-7次使之混匀；质粒小量提取的方法（手工提取）：第130页，共195页，星期日，2025年，2月5日加入150?l溶液III，加盖后颠倒6-7次混匀，放置5min;用台式高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml100％乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液;沉淀用0.5ml70％乙醇清洗一次，12000r/min离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥;加入30-50?l含有20?g/mlRNase的灭菌蒸馏水或TE缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提);将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。第131页，共195页，星期日，2025年，2月5日1、λ噬菌体的生物学特性三、λ噬菌体载体有尾部结构的二十面体λ噬菌体由外壳包装蛋白和DNA组成。第132页，共195页，星期日，2025年，2月5日裂解周期和溶原周期2、λ噬菌体的生活周期裂解周期第133页，共195页，星期日，2025年，2月5日E.coliT4噬菌体的生命周期（以分钟记）t=0噬菌体吸附到寄主菌的细胞壁，大约在吸附的2秒钟内就会发生噬菌体DNA的注入；t=1寄主DNA、RNA和蛋白质的合成反应被全部关闭；t=2第一个噬菌体mRNA开始合成；t=3细菌DNA开始降解；t=5噬菌体DNA合成开始启动；t=9“晚期”噬菌体mRNA开始合成；t=12出现完整的头部和尾部结构；t=15出现头一个完整的噬菌体颗粒；t=22细菌发生溶菌作用，释放出约300个左右的噬菌体时粒第134页，共195页，星期日，2025年，2月5日溶原周期λ噬菌体感染大肠杆菌后，通过同源重组，将其DNA整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种状态称为溶原状态，这个过程称溶原化。整合主要由λ-DNA上的cⅠ和int两基因的产物所激活。原噬菌体（prophage)：整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。第135页，共195页，星期日，2025年，2月5日第136页，共195页，星期日，2025年，2月5日3、λ噬菌体的基因组1）线状双链DNA分子，全长48.502bp。2）两端的5’末端具有12碱基的突出互补的粘性末端（cohensiveend，cos），该末端称为cos位点。3）当λ侵入宿主细胞后，线状DNA分子借助粘性末端连接成环状分子。5’--5’-3’3’-第137页，共195页，星期日，2025年，2月5日第138页，共195页，星期日，2025年，2月5日pBR322质粒载体tetr基因插入失活效应