DNA片段连接重组方法.pptxVIP

第五节DNA片段的连接重组;;

由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割产生单链突出的粘性末端和酶切位点附近的DNA序列不影响连接。在连接酶的作用下即可形成重组DNA分子。

缺点：载体自我环化、双向插入、多拷贝插入

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由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段，会在载体和目的基因两端产生非同源互补的2个黏末端。

外源DNA和载体DNA经过两个限制性内切酶切割后一侧产生的黏性末端，另一侧产生平未端（可先生成黏性末端再补平）

;二、平末端连接;提高平头末端连接效率的方法包括：

①加大连接酶用量；

②加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会；

③加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用；

;?当载体和外源DNA片段两端的酶切位点之间，不可能找到恰当的匹配时，解决方法：

⑴人工接头连接法：通过依次加入、连接合成DNA接头，再用限制酶切加以解决。

⑵同聚物加尾连接法：可以利用末端转移酶分别在载体酶切位点处和外源DNA片段的3’端加上相互补的同聚尾加以解决。

⑶PCR法：通过PCR(聚合酶链反应)技术扩增外源DNA片段，从而加上合适的限制性内切酶的单一识别序列，再用限制酶切加以解决。;

同聚物加尾连接：利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3′端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸。dA(dG)和dT(dC),然后在DNA连接酶的作用下,连接成为重组的DNA。

;优点：通过DNA加尾，既可以使两个具平末端的DNA片段进行连接，也可以使具平末端的DNA片段与粘性末端的DNA片段进行连接。

缺点：只对质粒载体有效；质粒和cDNA上的同聚物长度难以控制相等，影响克隆效率；用其转化宿主菌的效率依不同菌株而有较大差异。

;人工接头（DNA寡核苷酸连杆）是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

;优点：是进行DNA重组的一种既有效又实用的手段，兼具有同聚物加尾法和粘性末端连接法的优点，而且它可以根据实验的不同要??，设计出具有不同限制酶位点的人工接头。若在体外连接反应中增加人工接头的浓度，还会大大提高平末端DNA片段间的连接效率。

缺点：如果待克隆的DNA片段或基因的内部，也含有与所加的人工接头相同的限制酶切位点，这样在酶切消化人工接头产生粘性末端的同时，也会把克隆的外源基因切成不同的片段，从而为后继的操作造成麻烦。