第九章聚合酶链反应及相关技术.ppt

同一对引物同时扩增靶基因和内标准品，双通道荧光检测系统可以特异地同时检测出内标准品和靶基因的扩增产物，计算出靶基因起始拷贝数内参照系统避免了由于不同抽提效率导致的样本间的差异，使结果的重复性更好，定量更为准确,但仍不能监控内标准品和靶基因是否有一致的扩增效率二、定量PCR第61页，共86页，星期日，2025年，2月5日三、多重PCR(multiplexPCR)在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样本中多个靶片段第62页，共86页，星期日，2025年，2月5日四、PCR诱导定点突变1.引入点突变ABABP2P1PCR用酶A和B消化，将突变位点引入PCR产物第63页，共86页，星期日，2025年，2月5日2.引入大片段缺失四、PCR诱导定点突变第64页，共86页，星期日，2025年，2月5日一个分子的模板经过30个循环，理论上即可得230(约109)个拷贝产物实际反应中，每个循环的扩增效率大多约为85%左右三、PCR的反应条件第29页，共86页，星期日，2025年，2月5日扩增反应的平台效应：PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25～35个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。三、PCR的反应条件第30页，共86页，星期日，2025年，2月5日指数增长期线形增长期平台期循环数理论值实际值Log产物DNA4.PCR实时监测三、PCR的反应条件第31页，共86页，星期日，2025年，2月5日平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早平台效应产生的因素：引物二聚体的产生反应体系各组分的消耗引物和已扩增的DNA片段间的竞争等三、PCR的反应条件第32页，共86页，星期日，2025年，2月5日四、PCR技术的质量控制1.实验室的规范化设置试剂贮存和准备区标本制备区扩增反应区产物分析区第33页，共86页，星期日，2025年，2月5日2.防污染体系：正确设置实验室、严格规范实验操作、完整有效的去污染措施反应体系中以dUTP取代dTTP，加入尿嘧啶糖苷酶（UNG），破坏以往的扩增产物每次实验完毕后须用1g/L次氯酸钠清洁实验台面，或用254nm波长的紫外光近距离充分照射四、PCR技术的质量控制第34页，共86页，星期日，2025年，2月5日3.PCR技术的质量保证基因扩增检验的全过程的质量保证分析前分析中分析后室内质量控制和室间质量评价四、PCR技术的质量控制第35页，共86页，星期日，2025年，2月5日第二节以PCR为基础的相关技术第36页，共86页，星期日，2025年，2月5日第二节以PCR为基础的相关技术一、逆转录PCR二、定量PCR三、多重PCR四、PCR诱导定点突变五、连接酶链式反应六、随机扩增多态性DNA第37页，共86页，星期日，2025年，2月5日一、逆转录PCR（RT-PCR）以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术主要用于克隆cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等第38页，共86页，星期日，2025年，2月5日逆转录合成cDNA所用的引物：以PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物以oligo(dT)作为引物以人工合成的随机序列（六核苷酸混合物）作为引物一、逆转录PCR（RT-PCR）第39页，共86页，星期日，2025年，2月5日一、逆转录PCR第40页，共86页，星期日，2025年，2月5日二、定量PCR(quantitativePCR)对DNA或RNA样本的靶序列进行定量分析主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等第41页，共86页，星期日，2025年，2月5日荧光定量PCR（fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR），又称实时PCR(real-timePCR)FQ-PCR通过荧光信号对PCR过程中的产物量进行实时监测，精确计算出PCR的初始模板量二、定量PCR第42页，共86页，星期日，2025年，2月5日荧光信号的检测方法二、定量PCR1.DNA结合染料技术2.水解探针技术3.杂交探针技术4.分子信标技术第43页，共86页，星期日，2025年，2月5日1.DNA结合染料技术PCR反应体系中加入SYBRGreenI染料，能选择性地掺入至双链DNA分子中，并且产生强烈荧光PCR过程中，SYBR