免疫诊断技术课件.pptVIP

操作流程圖15min避光加入螢光標記的抗體各10μlEDTA抗凝血100μl溶解紅細胞、洗滌、固定FCM分析2、操作流程標本的準備免疫螢光染色數據的獲取結果的分析單細胞懸液大多數儀器是在50-300μm大小的孔徑中,將細胞懸液注射進入鞘液中這一過程,成為流體動力學聚焦樣本製備非常重要1）常見臨床檢測標本的準備血液或骨髓、培養細胞樣品體液和各種灌洗液各種組織血液或骨髓：EDTA-K2（1.5～2mg/ml）抗凝培養細胞樣品：胰蛋白酶消化PBS吹打懸浮低速離心5minPBS洗滌2次PBS懸浮沉澱細胞體液和各種灌洗液：包括脫落細胞、胸腹水細胞、尿液、內鏡刷檢細胞等離心取沉澱細胞PBS洗滌2次尼龍網過濾PBS懸浮各種組織：包括新鮮實體組織樣本、組織活檢或內鏡取材標本酶消化法機械法尼龍網過濾PBS洗滌2次化學處理法2）免疫螢光染色免疫螢光染色的類型（直接、間接）螢光染色的方法（單色、雙色、多色）螢光染料的種類螢光染色對照的設置螢光素標記的單抗直接染色操作簡便背景染色低直接免疫螢光染色間接免疫螢光染色螢光素標記的第二抗體未標記的第一抗體靈敏度高操作複雜背景染色增加103104101102100103104101102100103104101102100numberofcellsCD3CD4CD8單色免疫螢光染色雙色免疫螢光染色染色方法第一，表面染色第二，胞內染色第三，胞內和表面標記同時檢測螢光染料的種類及螢光光譜FITC（異硫氰酸螢光素）：綠色，530nmPE（藻紅蛋白）：橙黃色，575nmPerCP(多甲藻黃素葉綠素蛋白）：深紅色，675nmPI(碘化丙啶）：橙紅色，620nmAPC(別藻蘭蛋白）：紅色，660nm螢光染色對照的設置陽性對照：以陽性細胞（用於檢測的單抗所針對特異性抗原的細胞）為對照同型對照：以同一亞型的免疫球蛋白為對照最常見的抗體的亞型：IgG1IgG2aIgG2bIgG3IgM3）檢測的一般步驟設置檢測方案（PROTOCOL)染色標本（同型對照，補償管，檢測抗體）同型對照管調電壓電壓不變，補償管調補償電壓不變，補償不變，上檢測管檢測後直接閱讀結果4）流式細胞術在免疫學中的應用淋巴細胞亞群（T，B，NK）活化的淋巴細胞（活化標記）有功能的淋巴細胞（分泌細胞因數）抗原特異性淋巴細胞調控性免疫細胞抗原遞呈細胞先天免疫細胞嗜鹼性粒細胞CTL細胞CD8Treg細胞CD4CD25FoxP3Th1細胞CD4/IFNT細胞CD3Th2細胞CD4/IL-4Th17細胞CD4/IL-17①外周血淋巴細胞亞群檢測普通型態學檢查不能區分，流式最方便。側向散射光SS前向散射光FS淋巴細胞單核細胞嗜堿細胞粒細胞全血細胞裂解時的散射光嗜酸細胞嗜中性細胞CD4+T細胞CD8+T細胞總T細胞（CD3+）白細胞的精細分析：5色6個標記區分多種白細胞亞型。對照CD3：97％CD8：95％CD25：65％CD45RO：67％CD62L：55％治療細胞活化活化結合殺手②HIV感染患者CD4陽性T細胞的絕對計數HIV入侵人體的目標細胞是CD4陽性T細胞，感染後期能嚴重破壞T細胞，引起CD4細胞的減少CD4陽性T細胞的計數是診斷、療效觀察和預後的最重要指標CD4陽性T細胞絕對數量如果低於200細胞/ul，表明疾病將進入重症期Flow-Count微球絕對計數值相對計數值蛋白表達強度CD4+T細胞總T細胞愛滋病人CD4細胞③CD34+造血幹細胞計數臨床應用：骨髓移植供體骨髓或外周血造血幹細胞計數應用範圍：骨髓移植手術供體造血幹細胞採集準備，骨髓庫，幹細胞相關研究等CD34：0.31%④強直性脊柱炎（AS）的診斷臨床診斷AS的三個主要依據：臨床症狀：腰痛X-ray：骶髂關節融合免疫：HLA-B27陽性可以作為任何腰痛患者鑒別診斷HLA-B7/HLA-B27雙標記優於單標記之處：消除了由於正常HLA-B7與抗HLA-B27抗體之間的交叉反應造成假陽性的可能強直性脊椎炎支持診斷HLA-B27真正表