酶学分子克隆过程.pptVIP

三，cDNA5’末端扩增（5’-Race）第一种方法：第30页，共43页，星期日，2025年，2月5日第二种方法第31页，共43页，星期日，2025年，2月5日酶学分子克隆过程第1页，共43页，星期日，2025年，2月5日三。工具酶。1。限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）:识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割DNA双链结构的一类内切酶。根据酶的结构，所需要辅助因子及裂解DNA的方式不同，分为三类。I类：由三种不同的亚基组成，需要Mg++,SAM和ATP为辅助因子，这类酶识别部位复杂，特异性差。II类：由三种亚基组成，需要Mg++，ATP为辅助因子。III类：由一种亚基组成，其活性仅需要Mg++作为辅助因子，DNA切割就发生在特异识别的部位范围内。根据识别部位核苷酸组成的特点，可将识别部位分为四种类型。第2页，共43页，星期日，2025年，2月5日（1）回文结构：比如：EcoRI5‘-GAATTC–3’3‘-CTTAAG–5’KpnI5‘-GGTACC–3’3’-CCATGG–5’MspI5‘-CCGG–3’3’-GGCC–5’(2)间断回文结构:BglI5‘-GCCNNNNNGGC–3’3’-CGGNNNNNCCG–5’第3页，共43页，星期日，2025年，2月5日（3）简并序列AvaII5‘-GGA/TCC-3’3’-CCT/AGG-5’(4)非回文序列MboII5‘-GAAGAN8–3’3’-CTTCTN7-5’第4页，共43页，星期日，2025年，2月5日同识异切酶，比如HpaII,MspICCGG–-GGCC-所切割的DNA具有相同的粘性末端的一类酶：比如，SalI和XhoISalI5‘-GTCGAC–3’3’–CAGCTG–5’XhoI5‘-CTCGAG–3’3’-GAGCTC–5’二。修饰酶1。DNA聚合酶I：活性包括5‘?3’DNA聚合作用(2)3‘?5’外切酶活性(3)5‘?3’外切酶活性第5页，共43页，星期日，2025年，2月5日Klenow片段：DNA聚合酶IC端的大片段，活性包括(1)5‘?3’DNA聚合作用(2)3‘?5’外切酶活性用途：标记DNA的3‘末端修饰突出的3‘或5’末端以产生平端随机寡核苷酸引物介导的DNA标记克隆cDNA时合成第二链双脱氧法DNA测序2。T4DNA聚合酶：活性：DNA聚合酶活性3‘?5’端外切酶活性（单链或双链）缺少5‘?3’端外切酶活性第6页，共43页，星期日，2025年，2月5日放射性标记DNA片段的3‘末端选择性及无选择标记线性化双链DNA分子的3‘末端，即所谓的“置换合成”(3)变双链DNA的粘性末端成平端用途：3。T7DNA聚合酶（1）天然T7DNA聚合酶（T7基因5蛋白/硫氧还原蛋白复合物）（1）DNA聚合酶活性很强（2）3‘?5’末端外切酶活性（单链或双链）用途：A:延伸长的DNA模板B:用于定点诱变中互补链的合成C:应用于3‘末端的标记D:将双链DNA的粘性末端（5‘或3’末端突出）转变为平端第7页，共43页，星期日，2025年，2月5日(2)经修饰的T7DNA聚合酶：其3‘?5’外切酶活性可选择性的降低，或通过基因工程改造使之完全失活，而保留了DNA聚合酶活性。用途：用于DNA测序用于标记5‘末端突出的DNA的3’末端。由于它会在3‘端留下一个额外的碱基，因此不能应用于将粘性DNA末端转变成平端。4。反转录酶来源：禽类成髓细胞瘤病毒（avianmyoblastosisvirus,AMV）莫洛尼鼠白血病病毒（Moloneymurineleukemiavirus,MMLV）活性：1.RNA指导的DNA聚合酶活性2.DNA指导的DNA聚合酶活性（不具3‘?5’外切酶活性）3.具有RNaseH活性,即从5‘或3’端连续降解RNA与DNA杂种双链内的RNA链部分。第8页，共43页，星期日，2025年，2月5日用途：(1)将真核基因的mRNA转录成cDNA文库(2)对具有5‘突出端DNA片段的3’端进行填补和标记(3)代替Klenow酶用于DNA序列测定5.碱性磷酸酶（A