蛋白质工程第四讲分离纯化与分析讲课文档.ppt

蛋白质工程第四讲分离纯化与分析;二、分离分析的含义：

1、分离过程本身可以是分析过程

样品干扰严重，需通过分离再检查，

分离过程和分析过程耦合，分析性色谱技术（HPLC、TLC）

2、分离过程的分析——优化纯化工艺

分离过程管理：定性分析、定量分析、纯度、结构和功能分析等

3、基本要求：

客观、准确性，反映分析对象（目的物质）的真实性。

4、分析方法要求：

选择性（特异性）、精确度、灵敏度、重复性等

;三、如何理解分离纯化与分析（三个层次）

物质的分析离不开分离：

分析要求样品的纯度：对样品进行分离纯化：如蛋白质、核酸等结构与功能关系的分析；

物质分离纯化过程离不开分析检测：

分离组分的收集、纯度、含量和组分分析；即分离过程管理。

分离纯化过程即是分析检测过程：

电泳、HPLC/Ms、GC/Ms、薄层层析(TLC)等；

分析是对事物的感知，是眼睛、是手段;一、概述

1、一般原理：

依据分离对象（物质）的溶解度、大小在相态中的分配等特性对物质进行分离纯化。

2、基本程序：样品处理、粗分和精分（例如：蛋白质的分离纯化）

3、分类：

初级分离：沉淀法、膜分离、萃取法、离心法等

精制纯化：

吸附层析、凝胶过滤、离子交换、疏水性相互作用色谱、反向色谱、亲和层析;二、初级分离（要求：灵活运用）

目的——分离对象（物质）初步分离、浓缩、富集的过程。

方法及原理：

1、沉淀分级分离：

盐析分级：中性盐（NH4SO4、Na2SO4等等），例如蛋白酶等蛋白质类

等电点分级：

有机溶剂：

热沉淀：

其它：

盐复合物、酸碱变性、表面活性剂、

三氯乙酸、PEG、重金属等

联合使用：盐析—等电点;2、膜分离：

膜分离方法及原理：透析，微滤，纳滤，超滤，反渗透，电渗析

膜材料和特性：

有机膜：（醋酸纤维素、硝基纤维素、聚砜膜、聚砜酰胺膜、聚丙烯腈膜等）

陶瓷膜：陶瓷材料

膜组件：管式膜组件，平板式膜组件，螺旋卷式膜组件，中空纤维（毛细管）等

应用：菌体分离，小分子产物分离和回收，蛋白质的分离和回收、浓缩和纯化等，膜生物反应器。

3、萃取：

4、离心：

分类：低速离心、高速离心、超速离心

分离方式：差速离心、浮力密度离心（连续梯度、非连续梯度）

5、其它：盐复合物、酸碱变性、表面活性剂、三氯乙酸、PEG、重金属等

6、联用方法：膜过滤-盐析—等电点，离心—萃取，离心-盐析—等电点等等;B：精制分离—色谱分离：

（A）精制过程，纯度较高

（B）方法和原理：流动相和固定相的分配系数不同。分配平衡很快，流动相为平推流。

（1）吸附分离技术：吸附—解吸附平衡，固定相（吸附剂）—流动相（洗脱剂）分配系数不同和分配平衡。吸附—解吸附—再吸附的连续过程（固相和流动相之间连续分配的过程）

吸附剂：吸附剂的选择，表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强、成本低廉。

吸附剂的选择：根据吸附剂性质和被分离对象的性质选择。极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性强的吸附剂易吸附非极性强的物质。为了便于解吸附，对于极性大的分离对象，选择极性小的吸附剂，反之亦然。吸附剂的选择依靠经验和多次试验。;吸附剂的种类：羟基磷灰石、硅胶、氧化铝等

柱层析：羟基磷灰石，[Ca3(PO4)3OH2]，HA，酸性蛋白质、酶、核酸、病毒等生命大分子。硅胶：含硅醇基团（-Si-OH），氨基酸、甾体激素、皂苷类、类脂和色素等等。

薄层层析：例如，硅胶薄层层析和聚酰胺薄膜薄层层析

硅胶薄层层析：硅胶板，硅胶H（纯硅胶），能用腐蚀性强的显色剂；硅胶G（10%-15%煅石膏和5%淀粉的硅胶）；硅胶CMC（含羧甲基纤维素）；硅胶HF254(含荧光剂的硅胶H)，

硅胶板的制备：玻璃板，硅胶制备（加溶剂碾磨），铺板，活化，活化测定（约1mg苏丹黄、苏丹红和靛酚蓝混合物乙酸乙酯溶液点样，苯做展层剂，Rf大小苏丹黄苏丹红.靛酚蓝，苏丹黄Rf）0.5，苏丹红和靛酚蓝Rf之差在0.1—0.2)。

分析程序：点样，展层，显色。;TLC色素指纹图谱和灰度分析;聚酰胺薄膜薄层层析：

DNS—氨基酸分析，DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯），

灵敏度10-9~10-10mol/L。DNS-Cl和氨基酸或多肽在特定条件下反应。

DABTH-氨基酸的薄层层析分析蛋白质序列。

Edman降解试剂DABITC（4-N,N-二甲氨基偶氮苯-4’-异硫氰酸酯）进行微量蛋白质序列分析（2—10nmol肽样品）。;单向纸层析;双向纸层析;薄层层析;（2）凝胶过滤：排阻色谱或分子筛层析，根据分子颗粒大小进行分离

原理：分子在筛孔中自由扩散、渗透，由于分子在筛孔中的分配系数不同，将分子分离。排阻的范围为0—100%。

分配系数：分离化合物在内水和外水体积中的比例关系。

Kav=(Ve-Vo)/(Vt