RNAi实验设计与转染技术要点.pdfVIP

RNAi和siRNA转染

Dr.Jim

EngreenBiosystemCo.Ltd.

内容

第一部分RNAi实验基本概念

第二部分RNAi实验具体设计

第三部分siRNA转染过程相关问题及解答

第一部分

RNAi实验基本概念

主要内容

1.RNAi的概念

2.RNAi的启动途径

3.非哺乳动物系统的RNAi实验

4.哺乳动物系统的RNAi实验

5.RNAi效应表现

1.RNAi的概念

RNA干扰(RNAinterference)是双链RNA（dsRNA)特异

性地结合到与之序列互补的mRNA上，导致mRNA降解，

从而介导的转录水平表达抑制。

2.RNAi的启动途径

(1)dsRNA途径

(2)siRNA途径

(3)shRNA表达载体途径

(1)dsRNA途径

dsRNA:在非哺乳动物系统中，大于30bp的长双链

RNA(dsRNA)进入细胞后，经过胞质内双链特异性核

酸酶Dicer水解成21-23bp的siRNA，进一步导致RNAi

的发生。

但在绝大多数哺乳动物系统中，超过30bp的dsRNA会

引起细胞潜在的抗机制（干扰素效应）。

(2)siRNA途径

小干扰RNA，长21-23bp，双链。

作用机制：双链的siRNA解链并装配入RNA介导的静默

复合物(RISC)，siRNA的反义链RISC与mRNA分子

互补结合，并降解mRNA，最终导致特定表达的抑

制。

(3)shRNA表达载体途径

shRNA表达载体在细胞内表达shRNA后，在Dicer作用下

形成siRNA分子，导致RNAi的发生。

3.非哺乳动物系统的RNAi实验

如线虫、果蝇等可通过与靶序列互补的长链dsRNA

（通常200bp）介导RNAi的发生。

长链dsRNA通常可以通过体外转录获得。

4.哺乳动物系统的RNAi实验

通过转染siRNA：通常在3-7天可以维持较高的表达

抑制效应，效应期的长短主要取决于细胞的增殖速度和

siRNA的有效性。大部分RNAi实验可以在此时间段获得

结果，而且可以通过再次转染获得超过1周的表达

抑制时间。

通过转染shRNA表达载体，可以获得超过2周的表

达抑制时间，在长效RNAi实验时，选择shRNA表达载

体较为合适。

5.RNAi效应表现

RNAi效应导致的靶下调可在mRNA水平和蛋白水

平表现，也可能会在细胞形态等生理学方面表现。

第二部分

哺乳动物系统的RNAi实验设计

主要内容

1.需要短期抑制还是长效抑制?

2.采用siRNA进行实验的途径

3.构建shRNA表达载体进行实验

4.siRNA设计需要注意的问题

5.脱靶效应

6.转染是RNAi实验的瓶颈

1.需要短期抑制还是长效抑制?

1周以内，采用siRNA较好，无需构建载体，节省时间，

还可以采用2次转染的方法，延长RNAi作用的时间到2

周。

2周以上长效RNAi实验，采用shRNA表达载体较好，效

应持续时间长。

2.采用siRNA进行实验的途径

(1)化学合成：首选的siRNA方法，最快、最方便

(2)体外转录

(3)Dicer/RNaseⅢ酶解

这三种方法均可做荧光标记，可及时得知转染效率