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甘肃地区葡萄酒相关酵母菌的分离及其分类鉴定研究

一、研究背景与意义

（一）甘肃葡萄酒产业与微生物资源

近年来，甘肃葡萄酒产业凭借得天独厚的自然条件，在国内乃至国际市场上崭露头角。甘肃河西走廊、祁连山区等产区，光照充足，昼夜温差大，土壤条件适宜，为优质酿酒葡萄的生长提供了绝佳环境，已成为我国重要的优质酿酒葡萄主产区之一。

在葡萄酒酿造过程中，微生物发挥着关键作用，而葡萄酒酵母菌更是其中的核心角色。酵母菌的发酵活动直接决定了葡萄酒的酒精含量、口感、香气等关键品质指标，其多样性及菌群特征对地域特色葡萄酒的形成具有深远影响。据相关研究表明，在甘肃河西走廊产区，葡萄附生微生物中酵母菌数量可观，达到10?～10?cfu/g，显著高于细菌与霉菌，成为主导葡萄酒发酵过程的核心菌群，这凸显了酵母菌在甘肃葡萄酒产业中的重要地位。

（二）酵母菌分离鉴定的科学价值

酵母菌的准确分类鉴定是葡萄酒酿造领域的重要基础研究内容，对于发掘本土优良菌种、构建具有地域特色的酿造体系意义重大。过去，甘肃地区在酵母菌研究方面已取得一定成果，从葡萄表面及发酵液中成功分离出酿酒酵母、东方伊萨酵母、毕赤克鲁维酵母等11属18种酵母菌，初步揭示了该产区微生物资源的丰富性。然而，目前的研究仍存在诸多不足。地域特异性菌株的筛选工作尚需深入开展，这些独特菌株往往蕴含着适应本地环境的特殊基因，可能产生独特的代谢产物，为葡萄酒带来独一无二的风味。同时，酵母菌与葡萄酒风味物质之间的关联机制仍不明确，深入探究这一机制有助于酿酒师通过调控酵母菌的发酵过程，精准塑造葡萄酒的风味，提升葡萄酒品质。

二、材料与方法

（一）样本采集与预处理

本研究选取了甘肃地区具有代表性的葡萄酒产区及相关酒厂，包括武威、张掖、嘉峪关等产区，以及祁连酒厂、莫高产区等。在葡萄成熟季节，采集了‘赤霞珠’‘黑比诺’等多个酿酒葡萄品种的成熟果实。这些葡萄品种在甘肃地区广泛种植，且各具特色，‘赤霞珠’以其浓郁的风味和高单宁含量著称，而‘黑比诺’则以细腻的口感和优雅的香气受到青睐。

在样本采集过程中，严格遵循无菌操作原则，以确保采集的样本不受外界微生物污染。将采集的葡萄果实迅速带回实验室后，在无菌条件下进行破碎处理。破碎后的葡萄浆被用于富集果实表面附生的微生物，这些微生物中包含了我们研究所需的葡萄酒酵母菌。为了分离出其中的酵母菌，采用梯度稀释法将样品进行稀释，随后将稀释后的样品涂布于YPD培养基上。YPD培养基富含酵母生长所需的营养成分，如葡萄糖、蛋白胨和酵母提取物等，能够为酵母菌的生长提供良好的环境。将涂布后的培养基置于28℃的恒温培养箱中培养48小时，在此期间，酵母菌在培养基上生长繁殖，形成单菌落。这些单菌落将作为后续分离和鉴定的基础材料。

（二）酵母菌分离技术

选择性培养基分离：在酵母菌的分离过程中，选择性培养基发挥着关键作用。本研究采用WL营养琼脂培养基进行初筛。WL营养琼脂培养基中含有多种特殊成分，其中溴甲酚绿作为一种酸碱指示剂，能够通过显色反应区分不同的酵母属。不同的酵母菌在WL营养琼脂培养基上生长时，会因其代谢特性的差异而导致培养基局部酸碱度发生变化，进而使溴甲酚绿呈现出不同的颜色。例如，酿酒酵母在该培养基上生长时，会使培养基呈现绿色；而毕赤酵母属生长时则使培养基呈蓝色。除了颜色差异外，不同酵母菌在WL营养琼脂培养基上形成的菌落形态也各具特点。通过仔细观察菌落的表面光泽、边缘整齐度等形态特征，并进行聚类分析，我们能够从众多的菌落中筛选出具有代表性的菌株。这些代表性菌株将被进一步用于后续的鉴定和研究，以深入了解其生物学特性和在葡萄酒酿造中的潜在应用价值。

分子生物学分离辅助：除了利用选择性培养基进行分离外，本研究还结合了分子生物学技术，以提高酵母菌的分离效率和准确性。具体而言，利用葡萄汁培养基对自然发酵液中的酵母菌进行富集培养。葡萄汁培养基富含多种糖类、氨基酸和维生素等营养成分，模拟了葡萄果实的自然发酵环境，能够选择性地促进酵母菌的生长，抑制其他杂菌的繁殖。在富集培养过程中，酵母菌在葡萄汁培养基中大量繁殖，使其数量得到显著增加。随后，通过平板划线法对富集后的酵母菌进行纯化处理。平板划线法是一种常用的微生物分离技术，通过将样品在固体培养基表面进行多次划线，使样品中的微生物细胞逐渐分散，最终在培养基表面形成单个菌落。这些单个菌落即为纯化后的酵母菌菌株。通过上述方法，本研究成功从甘肃地区的葡萄样品中分离得到了127株酵母菌。以祁连酒厂的样品为例，分离得到的菌株被命名为L1-L146，这些菌株将作为后续深入研究的对象，用于探究其分类地位、生物学特性以及在葡萄酒酿造中的应用潜力。

（三）分类鉴定方法

形态学与生理生化鉴定：形态学和生理生化鉴定是酵母菌分类鉴定的传统方法，通过对酵