DB43∕T 697-2012 猪伪狂犬病病毒聚合酶链式反应检测方法.docxVIP

ICS11.220

B41

DB43

湖南省地方标准

DB43/T697—2012

猪伪狂犬病病毒聚合酶链式反应检测方法

MethodofthePolymeraseChainReactionfortheDetectionofPorcinePseudorabiesVirus

2012-07-24发布

2012-12-10实施

湖南省质量技术监督局发布

I

DB43/T697—2012

目次

前言 Ⅱ

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4仪器设备和试剂 1

5操作程序 2

6结果判断 3

附录A(资料性附录)试剂的配制 4

DB43/T697—2012

前言

本标准按GB/T1.1-2009的规则编制。

本标准由湖南省畜牧水产局提出并归口。

本标准起草单位：长沙市畜禽水产品质量检测中心，中国动物卫生与流行病学中心。

本标准主要起草人：王辉、刘增再、郑姣妹、宁华杰、唐爱明、卢艳芬、陈智、薛爽、吴发兴。

IⅡ

1

DB43/T697—2012

猪伪狂犬病病毒聚合酶链式反应检测方法

1范围

本标准规定了猪伪狂犬病病毒聚合酶链式反应(PCR)的检测方法。

本标准适用于猪组织中猪伪狂犬病病毒gE基因的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

猪伪狂犬病病毒PorcinePseudorabiesVirusPRV

猪伪狂犬病病毒在病原分类上属疱疹病毒科，疱疹病毒亚科。病毒完整粒子呈圆形，直径为(150~

180)nm,核衣壳直径(105～110)nm,有囊膜和纤突。基因组为线状双股DNA。

3.2

猪伪狂犬病PorcinePseudorabiesPR

猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的一种急性传染病。感染猪的主要临床特征为体温升高，新生仔猪表现神经症状，死亡率高，还可侵害消化系统。成年猪常为隐性感染，妊娠母猪感染后可引起流产、死胎及呼吸系统症状。

4仪器设备和试剂

4.1仪器设备

4.1.1移液器。

4.1.2高速离心机。

4.1.3PCR扩增仪。

4.1.4电泳仪。

4.1.5紫外凝胶成像系统。

4.1.6冰箱(-20℃)。

4.1.7研磨器。

4.2常用试剂

2

DB43/T697—2012

本标准所用试剂，除特殊标注外，均为分析纯。实验用水应符合GB/T6682的规定。试剂的配制参见附录A。

4.2.10.1mol/LPBS缓冲液(pH7.2)(参见附录A中A.1)。

4.2.2.DNA抽提试剂(参见附录A中A.2)。

4.2.320pmol/LPRV引物(参见附录A中A.3)。

4.2.4灭菌双蒸水(ddH20)(参见附录A中A.4)。

4.2.50.5U/μLTaqDNA聚合酶(参见附录A中A.5)。

4.2.6PCR缓冲液(参见附录A中A.6)。

4.2.7电泳缓冲液(50倍)(参见附录A中A.7)。

4.2.8电泳缓冲液(1倍)(参见附录A中A.8)。

4.2.91%琼脂糖凝胶(参见附录A中A.9)。

4.2.10上样缓冲液(参见附录A中A.10)。

4.2.1175%乙醇(参见附录A中A.11)。

4.2.128mmol/LNaOH灭菌水(参见附录A中A.12)。

5操作程序

5.1样品的采集和处理

5.1.1样品的采集：濒死猪、扑杀的成年猪和流产胎儿取脑、肝、脾、肺等组织病料。

5.1.2样品的处理：每份样品分别处理。取待检病料(1～2)g置研磨器中剪碎并研磨，研磨(3～4)min,加入1.0mLPBS缓冲液继续研磨；将研磨好的待检组织液，置1.5mL灭菌离心管中，5000rpm离心10min,取上清液提取DNA。

5.2DNA模板的提取

取出已处理的待检样品上清液250μL及阴性、阳性对照样品各250μL,分别置于新的1.5mL离心管，每管加入750μLDNAz