第三章基因工程载体 (2).pptVIP

该类载体经改造后的长度为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，其允许的插入片段最大为13.9kb（54.9-37kb）。由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因。（0-13.9kb）λgt10，可以携带8kb的DNA分子，插入位于cI基因内的单一的酶切位点EcoRI。插入失活导致裂解循环，从而很容易识别重组子。λZAPII，含有多聚接头，可以使用六种不同的限制性内切酶插入约10kb的新的DNA分子，通过lacZ’基因的插入失活鉴定重组子，不能形成蓝色的噬菌斑。该类载体经改造后的长度约为40kb，但在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或saλI），两者间的距离为14kb长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb长的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。显而易见，这类载体的容量不仅比插入型载体大，而且有一个下限：40-14kb=26kb包装下限为36.4kb，因此其载装下限为10.4而上限为25.5kb。这类载体实际上已经不再需要标记基因，因为空载的载体DNA只有26kb，不可能被包装，因而无法进入受体细胞中去，当然这类载体的使用较为繁琐，现在商品化了的取代型载体已去除了中间片段珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。与质粒不同，CⅠ基因的功能是促使噬菌体进入溶源化，但在正常情况下，它的噬菌斑是不清楚的，有点浑浊。这是因为在λ噬菌体感染时，有少数细胞进入溶源化途径，这些细胞生长在噬菌斑中，就造成了噬菌斑浑浊。由于cⅠ基因的产物——阻遏物的失活，不会有溶源菌的形成，因此，形成的噬菌斑都是清亮的，很容易将重组体与非重组体区别开来。cI阻遏物的名字就是指在该基因中插入一段DNA后会使噬菌斑的形态变得清亮(c=clear)。Da全称道尔顿（Dalton根据寄主细胞所含的拷贝数的多少，可将质粒分成两种不同的复制型：一种是低拷贝数的质粒，每个寄主细胞中仅含有1～3份的拷贝，我们称这类质粒为“严紧型”复制控制的质粒（stringentplasmid）；另一类是高拷贝数的质粒，每个寄主细胞中可高达10～60份拷贝，这类质粒被称为“松弛型”复制控制的质粒（relaxedplasmid）。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。控制细菌配对和质粒结合转移的基因，非结合性质粒失去控制细胞配对和自我转移的基因还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因这样的两种质粒称为不亲和质粒任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。不相容性质粒组成不相容性群。质粒的不相容性：分子机制两种质粒同源或近缘，它们利用同一复制系统会竞争资源，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，不能同时处于同一细胞。两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。如果含有内源质粒，也要考虑与克隆载体的质粒是否属于不亲和质粒。这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义二、质粒的构建（一）质粒构建基本策略1、加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择2、增加或减少合适的酶切位点，便于重组3、缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量4、改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝5、根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件灭活一些有害基因，比如与质粒移动有关的基因，或影响质粒复制的负调控基因等。通过选择具这种表型特征的转化子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型，直接选择转化后的细胞，提高了选择的敏感性。注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。并能在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体（expressionvectors）。一种典型的大肠杆菌表达型质粒载体（图4-11）的主要组成部分，包括大肠杆菌的启动子及操纵全点序列、多克隆位点、转录及转译信