基因工程第三章基因工程的载体.ppt

*苏州科技学院生物系叶亚新第一节E.coli质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建4、人工组建克隆载体-pUC系列质粒pUC系列质粒的优点更小的相对分子量和更高的拷贝数可用组织化学法检测重组体具有多克隆位点（MCS）区段是基因工程中目前最常用的E.coli克隆载体第29页，共58页，星期日，2025年，2月5日*苏州科技学院生物系叶亚新第一节E.coli质粒载体三、质粒（plasmid）的制备碱裂解法?（1）将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液体中?（2）加溶菌酶裂解细菌细胞壁?（3）加NaOH与SDS的混合溶液，去膜释放内含物?（4）加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质?（5）离心取上清液，用苯酚－氯仿溶液处理，灭活去除痕量蛋白质及核酸酶?（6）乙醇或异丙醇沉淀水相质粒?（7）无DNase的RNase处理残余RNA第30页，共58页，星期日，2025年，2月5日*苏州科技学院生物系叶亚新第一节E.coli质粒载体三、质粒（plasmid）的制备沸水浴法?（1）将菌体悬浮在含有EDTA和TritonX-100的缓冲液中?（2）加溶菌酶破细胞壁?（3）放入沸水浴中煮40秒?（4）离心，用无菌牙签挑去沉淀物?（5）乙醇异丙醇沉淀第31页，共58页，星期日，2025年，2月5日*苏州科技学院生物系叶亚新一、Ti质粒载体1.根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)与Ti质粒G-菌，可侵入90科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤(crowngalltumor)。冠瘿瘤细胞具有以下特征：i.不需要补充植物激素便可进行离体培养ii.合成肿瘤特有的化合物—冠瘿碱(opine)，能专一的为根癌农杆菌所利用.这两个特征由Ti质粒决定，但该质粒中仅有一部分进入植物细胞。三、其他质粒载体第32页，共58页，星期日，2025年，2月5日*苏州科技学院生物系叶亚新二、酿酒酵母(Saccharomyceacerevisiae)的分子克隆载体1.克隆载体的种类1)按复制方式划分i.???自主复制型；ii.整合型（非自主复制型）YeastIntegrationplasmid(YIp)2)按复制子来源划分????????????i.附加体型-yeastepisomalplasmid(YEp)，其复制起点来自于酿酒酵母的天然质粒-2μ质粒???????????ii.染色体复制型-YeastReplicatingplasmid(YRp)，其复制起点来自染色体上的自主复制序列(ARS-autonomousreplicatingsequence)三、其他质粒载体第33页，共58页，星期日，2025年，2月5日*苏州科技学院生物系叶亚新4.pYAC载体酵母菌人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)广泛用于构建高等动植物基因组文库的构建,由YLp经适当改造后构建成pYAC载体。pYAC载体具有以下特点：1）双TEL位点；2）三个酵母菌遗传标记基因；3）一个SUP4基因用于检测重组子，其原理是：SUP4是tRNAtyr的赭色抑制突变基因，但把该基因转入酵母菌的ade2赭色突变体时，宿主菌为白色菌落，要是在SUP4基因中插入外源DNA片段后在转化ade2宿主菌，转化子成红色菌落。第34页，共58页，星期日，2025年，2月5日*苏州科技学院生物系叶亚新YAC:酵母人工染色体（yeastartificialchromosome）目前能容纳最大外源DNA片断的载体.YAC载体有两个臂，每个臂的末端有一个端粒（TEL），臂上有着丝粒（CEN）、自主复制序列（ARS）、选择标记（TRP1和URA3）装载容量：50Kb---2000KbYAC载体是以质粒的形式出现，如：pYAC2第35页，共58页，星期日，2025年，2月5日*苏州科技学院生物系叶亚新第36页，共58页，星期日，2025年，2月5日*苏州科技学院生物系叶亚新第二节