DB23T 2989-2021 玉米线虫矮化病病原长岭发垫刃线虫鉴定技术规程.docxVIP

ICS65.020.20CCSB16

DB23

黑龙江省地方标准

DB23/T2989—2021

玉米线虫矮化病病原长岭发垫刃线虫鉴定

技术规程

2021-09-08发布

2021-10-07实施

黑龙江省市场监督管理局发布

I

DB23/T2989—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本文件由黑龙江省农业农村厅提出。

本文件起草单位：中国科学院东北地理与农业生态研究所、先正达（中国）投资有限公司。

本文件主要起草人：潘凤娟、李峰、胡岩峰、刘聃、陆欣春、严君、邹文秀。

DB23/T2989—2021

1

玉米线虫矮化病病原长岭发垫刃线虫鉴定技术规程

1范围

本文件规定了玉米长岭发垫刃线虫（Trichotylenchuschanglingensis）鉴定的取样时期、取样方法、仪器使用、线虫分离、线虫鉴定和管理档案。

本文件适用于玉米田的玉米线虫性矮化病病原玉米长岭发垫刃线虫（T.changlingensis）的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T29577—2013腐烂茎线虫检疫鉴定方法

SN/T1141鳞球茎茎线虫检疫鉴定方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

长岭发垫刃线虫（T.changlingensis）

属于线虫门（Nematoda）、侧尾腺纲（Secernentea）、垫刃目（Tylenchida）、锥科（Dolichodoridae）、发垫刃属（Trichotylenchus）。

3.2

玉米线虫矮化病

由线虫侵染玉米根部引起的一种玉米苗期病害。玉米4～5叶期症状明显，沿着叶脉方向出现黄色或白色失绿条纹，茎基部组织纵向或横向开裂、呈“虫道”状，大部分植株茎节缩短膨大，矮缩或丛生，不结果穗或果穗发育不良。

4取样时期

在玉米4～5叶期，玉米出现矮化症状时取样。

5取样方法

采用对角线五点取样法，用土壤取样器采集疑似发病植株根围离土表5cm～15cm的土壤约500g，放入塑料袋中，检测前土样保存在4℃~8℃条件，最长14d。取样应在土壤湿润时进行，避免在土壤过干或浸水时取样。取样调查参见附录A。

6仪器用具

6.1仪器

2

正置显微镜、体式显微镜、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、高速离心机、制冰机、纯水仪、-80℃冰箱、移液枪和水浴锅。

6.2用具

500目土样筛、挑针和玻片。

7线虫分离

线虫分离应按照SN/T1141中的规定执行。

8线虫鉴定

8.1形态学鉴定

8.1.1标本制作

按照SN/T1141中的附录C的要求执行。

8.1.2线虫形态观察

在显微镜下观察，雌虫虫体较长，呈圆筒状，固定后呈C状；唇区高，缢缩明显；口针细长，口针基部球略向后倾斜，侧区3条侧线，尾亚圆柱形，末端光滑无环纹。雄虫虫体略小于雌虫，交合刺发达，略弯曲，引带发达，交合伞起始于交合刺基部前，包至尾尖。对线虫标本的形态观察，应严格按照GB/T29577规定执行。参见附录B。

8.2分子生物学鉴定

依据形态学鉴定结果，再采用分子生物学技术进行鉴定。

8.2.1线虫DNA提取

将线虫置于灭菌去离子水中清洗，挑取单条线虫，切成2段放入10μL裂解缓冲液[1×PCRBuffer（Mg2+）和6μg蛋白酶K]中，液氮冷冻2min，反复冻融2～3次，60℃水浴30min，95℃10min，12000r/min离心10min，取上清DNA提取液，-20℃保存备用。

8.2.2线虫28SrDNA测序

采用线虫通用引物D2A（5-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3）和D3B（D3B（5-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3）扩增线虫的28SrDNA序列，扩增产物约900bp。PCR反应体系：44μLPCRMix，上游引物和下游引物各2μL，DNA模板约10ng。反应条件95℃4min；一个循环包括94℃30s，55℃45s，72℃45s，共40个循环，最后72