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摘要
劳森菌(Lawsoniaintracellularis,LI,又称胞内劳森菌)是一种专性细胞内
寄生菌,世界各地相继报道了关于动物感染劳森菌的病例,我国该病在猪上的阳
性率高达79.1%,造成了巨大的经济损失。近年来,劳森菌感染而引起的猪消化
道疾病明显增加,给养猪业带来了巨大的经济损失,已经成为制约养猪业可持续
发展的重要瓶颈。多项研究显示,溶血素可作为细菌致病的重要毒力因子,在动
物细菌性疾病的发病过程中有不可忽视的作用。然而,劳森菌溶血素A样蛋白
LhlyA(LI0004蛋白)的毒性作用机制未见报道。因此,本研究通过制备LI0004
蛋白多克隆抗体,研究其在检测劳森菌感染中的应用,并以IPEC-J2细胞和小鼠
为模型构建体内外模型,明确LI0004蛋白作为毒力因子在劳森菌感染细胞中的
作用机制,阐明LI0004蛋白在劳森菌感染时调节细胞周期信号通路激活及毒性
作用机制中的作用,为研发抗劳森菌毒力因子的药物提供靶标,进一步为劳森菌
感染的动物疫病防控提供科学依据。本论文开展了以下3方面研究:
1.LI0004蛋白多克隆抗体的制备方法和应用
通过NCBI查找并设计LI0004蛋白引物,PCR扩增目的基因后通过同源重
组连接至表达载体pColdⅠ。获得重组质粒pColdⅠ-LI0004并进行菌落PCR鉴定
和测序分析,将鉴定并测序正确的pColdⅠ-LI0004重组质粒转化至大肠杆菌表达
感受态细胞Rosetta(DE3)中进行诱导表达的IPTG浓度、诱导时间和诱导温度
的优化,并通过蛋白纯化得到纯化的LI0004蛋白。将纯化的融合蛋白免疫大耳
白兔4次(每20天1次),经效价试验、ELISA、抗体纯化、Westernblot检测
等试验获得高效价高纯度的多克隆抗体。结果显示,LI0004蛋白在上清中表达,
且在IPTG浓度为0.1mM、诱导时间为24h、诱导温度为16℃时上清中的表达
量最高。在抗LI0004血清稀释度为1:512000时,样品OD450值/阴性对照OD450
6
值为2.10,抗LI0004血清的效价达1:10。Westernblot试验结果显示,LI0004
蛋白的多克隆抗体可以特异性地与劳森菌总蛋白、LI0004蛋白结合,但在大肠
杆菌(Escherichiacoli,E.coli)总蛋白中,未检测到与其结合的抗原。结果表明
LI0004蛋白的多克隆抗体的特异性良好。此外,应用试验结果显示,劳森菌活
疫苗感染IPEC-J2细胞后,LI0004蛋白主要定位于细胞核、细胞质中,表明以纯
化的LI0004原核蛋白为免疫原制备的多克隆抗体还可以用于劳森菌感染细胞的
免疫荧光分析。
2.LI0004蛋白通过Notch信号通路对IPEC-J2细胞增殖的影响机制研
究
采用IPEC-J2细胞,构建体外劳森菌感染模型,研究LI0004蛋白作为毒力
因子在劳森菌感染细胞中的作用机制,阐明LI0004蛋白在调节细胞周期信号通
路激活及毒性作用机制的关系。首先,用不同浓度的LI0004蛋白孵育IPEC-J2
细胞,确定LI0004蛋白感染IPEC-J2细胞的浓度及其对IPEC-J2细胞增殖的影
响。其次,不同浓度的LI0004蛋白孵育IPEC-J2细胞后,采用Westernblot法检
测IPEC-J2细胞Notch通路以及周期蛋白的表达情况,并通过流式细胞术分析
细胞增殖情况。最后,采用间接免疫双标荧光技术结合免疫共沉淀(Co-IP)试
验及RNA干扰(RNAi)技术进一步分析Notch1在LI0004蛋白引起的IPEC-J2
细胞增殖中的作用机制。结果显示,0.02、0.04和0.08mg/mL的LI0004蛋白孵
育IPEC-J2细胞24h后,提取细胞总蛋白,通过Westernblot试验检测到了LI0004
蛋白,且随孵育剂量的增加而增加,说明LI0004蛋白可进入IPEC-J2细胞而发
挥作用。CCK8细胞活力试验结果显示,0.02、0.04和0.08mg/mL的LI0004蛋
白呈剂量依赖性的促进IPEC-J2细胞的增殖
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