PCR的原理和操作过程.pptVIP

PCR原理和基本操作过程

2015.12.5

临床146生化实验小组

第一节PCR技术原理

聚合酶链式反应（polymerasechainreation,PCR)是一种DNA体外核酸扩增技术。该技术能在短时间内将极微量的目的基因或某DNA片段扩增至十万乃至百万倍，从极微量的标本中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。PCR技术具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。

PCR基本原理

PCR基本反应步骤

一、PCR的原理

PCR技术是一种在体外模拟DNA的复制过程的核酸扩增技术。其原理是根据DNA的半保留复制，以及DNA分子在体外不同的温度下双链和单链可相互转变的机制，在体外人为地控制反应系统的温度，使双链DNA变性，成为单链DNA；其次，单链DNA与人工引物链在退火过程中配对结合；最后，在DNA聚合酶的催化作用下，使引物沿单链模板延伸为双链DNA，实现DNA的扩增。PCR三个基本反应步骤构成，即变性、退火、引物延伸。

二、三个基本步骤

变性(denaturation)-高温下将模板DNA双链打开

退火(annealing)-引物在较低温度下以共价键结合到模板DNA互补部位

延伸(extension)-TaqDNA聚合酶作用下，不断向引物3’端添加DNTP，DNA链不断延伸

反应液中含有所有成分，以温度变化来控制反应阶段：

变性95度，退火55度，延伸72度。

重复1~3步

25~30轮

目的DNA片段

扩增100万倍以上

DNA双螺旋

DNA单链

与引物复性

DNA变性

形成2条单链

子链延伸

DNA加倍

PCR的基本原理

PCR反应条件

PCR过程

PCR的特点

模板DNA

变性

第一轮扩增

PCR的基本原理

PCR反应条件

PCR过程

PCR的特点

引物1

引物2

退火

PCR的基本原理

PCR反应条件

PCR过程

PCR的特点

引物1

引物2

Taq酶

Taq酶

延伸

PCR的基本原理

PCR反应条件

PCR过程

PCR的特点

第1轮结束

第2轮开始

PCR的基本原理

PCR反应条件

PCR过程

PCR的特点

Taq

Taq

Taq

Taq

PCR的基本原理

PCR反应条件

PCR过程

PCR的特点

第2轮结束

PCR的基本原理

PCR反应条件

PCR过程

PCR的特点

模板DNA

第1轮扩增

第2轮扩增

第3轮扩增

第4轮扩增

第5轮扩增

第6轮扩增

PCR的特点

PCR的特点

第二节PCR的实验步骤

标准的PCR反应体系

10X扩增缓冲液：5μl

模板DNA:0.1~2μg

引物：各0.2~1μmol/L

4种dNTP:各200μmol/L

Mg2+:1.5mmol/L

TaqDNA聚合酶：2.5U

ddH2O补齐

总体积：50μl

可以按照比例放大或者缩小体系，不同的PCR反应需要优化

按照实验方案进行即可

1.加样将上述总体积为50чl的反应体系加入一无菌0.5ml离心管中

2离心将加入的反应物混合均匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上

3扩增在PCR仪上设置PCR反应参数（具体数据根据引物和扩增片段的大小而定）：94℃下加热4分钟左右；依次94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，循环32次左右；72℃下保温7分钟，使反应产物扩增充分

4PCR扩增产物分析PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。ＰＣＲ产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法

PCR循环参数

（热力学参数）

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