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二色补血草几丁质酶基因chi31和chi32的原核表达与重组酶特性解析

一、绪论

1.1研究背景与意义

植物病虫害是全球性的自然灾害，其危害面积广泛，造成的经济损失巨大。据统计，植物病虫害的危害面积是火灾面积的1000倍，经济损失是火灾的100倍。在众多防治植物病害的方法中，利用几丁质酶来提高植物的抗真菌能力成为了研究热点之一。几丁质是构成大多数真菌细胞壁的主要成分，几丁质酶（Chitinase,EC3.2.14）作为一种能降解几丁质及其衍生物的糖基水解酶，能够催化真菌细胞壁中几丁质的水解，从而抑制真菌的生长增殖，进而提高植物的抗真菌能力。几丁质酶广泛存在于各种微生物、植物及动物细胞和组织中，参与多种生理过程，如在自然界的物质循环中，几丁质酶可以有效降解几丁质，发挥着不可替代的作用。

从应用领域来看，几丁质酶具有巨大的应用潜力，在生物防治、几丁质资源的利用等方面受到了广泛的重视。在生物防治领域，将细菌及植物几丁质酶基因转入烟草、番茄、大豆、马铃薯、莴苣和甜菜等植物中，获得的转基因植物高效表达几丁质酶的生物活性，可显著抵抗真菌病害；将几丁质酶基因转入生防真菌中，也能显著提高生防真菌拮抗植物病害的能力。在几丁质资源利用方面，几丁质酶可用于制备生物制品、废弃物处理、食品加工等领域。例如在食品加工中，几丁质酶能够水解双孢蘑菇细胞壁几丁质，抑制蘑菇菌柄伸长，调控双孢蘑菇后生长过程。在环境保护领域，几丁质酶能够优化农业环境，减少农业废弃物并增强肥效，还可被应用于净化工业废水、减轻污染等环境问题。

二色补血草（Limoniumbicolor）是一种常见的植物，其根和叶都含有丰富的生物活性物质，如铁、维生素C、多糖等，同时具有很好的抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性。二色补血草中的几丁质酶基因chi31和chi32编码了两种几丁质酶，均具有丰富的生物活性。研究立枯丝核菌胁迫条件下，chi31和chi32基因在二色补血草中的表达模式发现，这两个基因能够应答真菌胁迫，对真菌病害的侵入均有防御反应，并且在同一组织中，两基因在表达上存在时间上的先后；在不同组织中，同一基因的表达量也存在差距，说明这两个基因可能在二色补血草中起到不同的作用，或分别隶属于不同的生物学途径。

对二色补血草几丁质酶基因chi31和chi32进行原核表达及重组酶分析具有重要意义。一方面，通过原核表达可以获得大量的重组几丁质酶，为后续深入研究其生物学功能和酶学性质提供充足的材料。原核表达是一种将目的蛋白转化为重组蛋白并产生大量蛋白的技术，通过构建适当的表达载体质粒，将chi31和chi32基因插入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，利用IPTG等诱导物质进行诱导，可将目的蛋白大量表达出来。另一方面，对重组酶进行分析，能够更深入地了解这两个基因编码的几丁质酶的特性，如酶活性、热稳定性、底物特异性等。这不仅有助于揭示二色补血草抵抗真菌病害的分子机制，还为开发基于几丁质酶的生物防治制剂提供理论依据和技术支持，在农业生产中具有潜在的应用价值，有望减少化学农药的使用，降低环境污染，实现农业的可持续发展。

1.2研究目的与内容

本研究旨在通过原核表达技术，对二色补血草几丁质酶基因chi31和chi32进行高效表达，并对获得的重组酶进行全面的分析，深入了解这两个基因编码的几丁质酶的生物学功能和酶学性质，为其在生物防治和农业生产中的应用提供理论依据和技术支持。具体研究内容如下：

构建表达载体：从二色补血草中提取总RNA，通过RT-PCR技术扩增出chi31和chi32基因的完整开放阅读框。将扩增得到的基因片段与原核表达载体（如pET-28a、pET-30a等）进行连接，构建重组表达载体pET-chi31和pET-chi32。通过双酶切鉴定、PCR鉴定和测序分析等方法，确保重组表达载体构建的准确性。

原核表达：将构建好的重组表达载体转化到大肠杆菌表达菌株（如BL21(DE3)、Rosetta(DE3)等）中，筛选出阳性转化子。对阳性转化子进行诱导表达，优化诱导条件，如IPTG浓度、诱导时间、诱导温度等，以提高重组几丁质酶的表达量。通过SDS电泳分析，检测重组几丁质酶的表达情况，确定其分子量大小和表达形式（可溶性表达或包涵体表达）。

重组酶分析：采用亲和层析、离子交换层析等方法，对重组几丁质酶进行纯化，获得高纯度的重组酶。运用酶活性测定方法，如对几丁质底物（胶体几丁质、乙二醇几丁质等）的水解活性测定，确定重组酶的酶活性大小。研究重组酶的酶学性质，包括最适温度、最适pH值、热稳定性、pH稳定性、金属离子对酶活性的影响等。分析重组酶对不同真菌细胞壁的降解能力，以及对真菌生长