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霉菌的分离、纯化与鉴定

怎样鉴定微生物呢？Page?2微生物鉴定主要是要回答两个问题：它是不是某一种菌？——针对性；——规范的检测鉴定方法；——如：致病菌检测；它到底是什么菌？——常规鉴定；——大致的工作步骤；——如：筛菌，潜在用途；

分离资源微生物的基本原则Page?3微生物可谓无处不在，获得什么样的微生物，取决于分离的目的：特定类群微生物的分离（定向分离）；获取新资源（分离未知菌）；分离“混合菌”（完成某种功能的一组菌）；分离的基本原则是：获得目的菌；排除非目的菌；

总思路流程Page?4采样预处理初筛复筛形态学观察生理生化实验分子生物学方法1、微生物资源的分布；2、样品的采集：2h、4℃；1、目的菌的富集培养；2、减少非目的菌；3、目的菌的充分释放；1、培养基设计原则；2、分离方法介绍；3、培养条件；1、获得纯培养；2、选择目的菌株；1、霉菌简介；2、菌落形态；3、霉菌制片观察；18SrRNA1、真菌的系统发育谱；2、微生物快速鉴定技术；

一、微生物资源的分布及样本的采集Page?5植物和动物：04确保样品的完整性，迅速对植物切口进行消毒，并用石蜡封住以防外来菌种入侵，用无菌装置带回；如动物粪便的采集应在动物排便后马上收集其中间部分，避免外源污染，置于无菌袋内；极端环境：03尽量存放在与采样环境相当的条件下至菌种分离；海洋环境及湿地：025μm的滤膜过滤水样，以增加出菌率；Ekmann型采泥器或重锤式取样器采集；样品装入无菌瓶内，不能密封，在3h内用于实验；土壤环境：01每年春季或旱雨季之交，一般在3-5月为佳；通常采集10-40cm深处的土样；若要分离放线菌和真菌，土样应放到无菌牛皮纸袋中，一般不放在瓶子或塑料袋中；如果要分离细菌，最好要保湿；

二、样品的预处理Page?6根据目的菌的生理特性，加入其所需要的营养物质及微量成分进行诱导增殖，增菌；设计特定的有利于待分离菌株生长的环境。——为了分离铁硫杆菌，可将样品加硫磺后培养；——为了分离分解纤维素或角蛋白等的酶产生菌，可以将样品与高浓度的纤维素或角蛋白（适当加入其他成分）在适当温度下保湿培养一段时间，再进行分离；目的菌的富集培养——若目的菌耐干燥，则可通过干燥减少非目的菌；——若要分离高温菌，可在特定高温下震荡培养若干时间，以减少非耐热菌的干扰；——加入非目的菌的抑制剂；减少非目的菌——使目的菌与样品基质分离：加入活化剂或乳化剂；震荡及超声波处理，DDC技术；酶法或研磨等组织破碎法；目的菌的充分释放

三、初筛Page?7设计选择性培养基，稀释涂布，挑选目标菌株。1、培养基设计原则合适的营养物质及浓度配比，如不同的C/N源；各无机盐比例适当；合适的渗透压或水分活度；适宜的pH等；⑴具体如下：开发意图贯穿分离过程，使培养基“只”满足目的菌的要求，而非目的菌不长；eg.寻找低温碱性脂肪酶产生菌大剂量加入同类化合物；eg.酒精酵母特殊成分；eg.维生素、氨基酸、无机盐等抑制剂：真菌抑制剂：放线菌酮、制霉菌素等；细菌抑制剂：青霉素、链霉素；萘啶酸可抑制革兰氏阴性细菌；放线菌分离中，选用重铬酸钾做抑制剂能很好的抑制细菌和真菌，几乎不影响放线菌的生长；

Page?8⑵常用培养基◆细菌——牛肉膏蛋白胨培养基（肉汤培养基）；◆放线菌——高氏一号培养基；◆霉菌——马铃薯葡萄糖培养基（PDA）、查氏酵母膏琼脂培养基(CYA)、麦芽汁琼脂培养基(MEA)、甘油硝酸盐琼脂培养基(G25N)、察氏培养基(CA)、孟加拉红培养基、豆汁培养基、其他；PDA培养基成分：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、自来水1000ml、自然PH约6.0察氏培养基成分：硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂20g、蒸馏水1000ml孟加拉红培养基成分：蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g、琼脂20g、1/3000孟加拉红溶液100ml、蒸馏水1000ml、氯霉素0.1g上述各成分加入蒸馏水中溶解后，再加孟加拉红溶液。另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中，分装后，121℃灭菌20min注意事项：①在加入凝固剂之前调pH值；②加酸碱要缓慢，多搅拌；③加热杀菌后pH值下降。

2、分离方法介绍Page?9获得微生物纯培养的几种常用方法(一)固体培养基分离方法1.涂布平板法2.稀释倒平板法3.平板划线法4.稀释摇管法特点：操作简单，是常规方法；缺点：易因涂布不均使某些部位菌落不能分开，不易于计数；注：取样液约；特点：菌落分离均匀，计数相对