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纯化大肠杆菌课件

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目录

01

大肠杆菌概述

02

大肠杆菌的培养

03

大肠杆菌的纯化技术

04

纯化过程中的质量控制

05

纯化大肠杆菌的实验操作

06

纯化大肠杆菌的案例分析

大肠杆菌概述

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01

大肠杆菌的定义

大肠杆菌属于肠杆菌科，是革兰氏阴性菌，广泛存在于人类和动物的肠道中。

生物学分类

大肠杆菌呈杆状，大小约为1-3微米，具有鞭毛，能在多种培养基上生长。

形态特征

大肠杆菌的生物学特性

大肠杆菌呈杆状，大小约为1-2微米，常见于人类和温血动物的肠道内。

形态特征

大肠杆菌能在多种培养基上生长，最适生长温度为37℃，需氧或兼性厌氧环境。

生长条件

大肠杆菌能发酵多种糖类，产生酸和气体，是肠道内重要的发酵菌之一。

代谢特性

大肠杆菌的基因组较小，约为4.6百万碱基对，易于进行遗传操作和基因工程研究。

遗传特性

大肠杆菌在研究中的应用

大肠杆菌作为基因工程的常用宿主，广泛应用于基因克隆、表达和蛋白质生产。

基因工程的模型生物

通过研究大肠杆菌的代谢途径，科学家们可以了解和优化生物合成路径，用于生产生物燃料和化学品。

代谢途径研究

利用大肠杆菌进行抗生素敏感性测试，帮助研究新药效果和细菌耐药性发展。

抗生素研究

01

02

03

大肠杆菌的培养

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02

培养基的制备

根据大肠杆菌的营养需求，选择合适的碳源、氮源、无机盐和生长因子。

选择合适的培养基成分

大肠杆菌适宜在pH7.0左右的环境中生长，因此需调节培养基至适宜pH值。

调节培养基pH值

通过高压蒸汽灭菌或过滤灭菌，确保培养基无其他微生物污染，适合大肠杆菌生长。

灭菌处理

根据实验需求，向培养基中添加特定抗生素，以筛选出具有抗性基因的大肠杆菌。

添加抗生素

培养条件的优化

通过调整培养基中的碳源、氮源和无机盐等成分，提高大肠杆菌的生长速率和产量。

优化培养基成分

精确控制培养温度在37℃左右，以模拟大肠杆菌的自然生长环境，促进其快速繁殖。

控制培养温度

维持培养基的pH值在7.0左右，为大肠杆菌提供最佳的生长条件，避免酸碱度不适导致的生长抑制。

调节pH值

通过摇床培养或通入无菌空气，确保大肠杆菌在有氧条件下生长，提高细胞活性和产物产量。

优化氧气供应

培养过程的监控

通过测量培养液的OD值，监控大肠杆菌的生长密度，以判断培养状态和细胞浓度。

光学密度测量

使用溶氧仪监控培养过程中的氧气水平，保证大肠杆菌在有氧条件下生长。

溶氧量控制

定期检测培养基的pH值，确保其在适宜范围内，以维持大肠杆菌的正常生长。

pH值监测

大肠杆菌的纯化技术

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03

离心纯化法

根据大肠杆菌的密度和大小，选择适当的转速和时间进行离心，以分离细胞和培养基。

选择合适的离心条件

01

通过在离心管中建立密度梯度，可以更有效地分离不同密度的细胞和细胞碎片。

使用密度梯度离心

02

离心后，需小心收集沉淀，避免细胞破裂，并进行后续的洗涤和浓缩步骤以纯化大肠杆菌。

离心后处理

03

色谱纯化法

利用不同物质在固定相和流动相中的分配系数差异进行分离，高效纯化大肠杆菌。

高效液相色谱（HPLC）

根据分子大小差异进行分离，适用于大肠杆菌及其代谢产物的分离纯化。

凝胶渗透色谱

通过电荷相互作用分离大肠杆菌，适用于带电蛋白质和核酸的纯化。

离子交换色谱

其他纯化方法

利用不同物质在离心力作用下在密度梯度介质中迁移速率的差异进行分离纯化。

密度梯度离心法

通过抗原-抗体特异性结合原理，利用抗体固定化柱子来捕获并纯化目标蛋白。

免疫亲和层析

利用带电粒子在电场中迁移速率不同，通过凝胶电泳等方法实现蛋白质的分离和纯化。

电泳纯化技术

纯化过程中的质量控制

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04

纯度检测方法

通过SDS电泳可以观察蛋白质的分子量和纯度，是纯化大肠杆菌常用的质量控制方法。

SDS电泳分析

质谱分析可以提供蛋白质的精确分子量和结构信息，是验证蛋白质纯度和鉴定的重要手段。

质谱分析

HPLC能够分离和定量分析样品中的蛋白质组分，确保纯化过程中的蛋白质纯度达到实验要求。

高效液相色谱（HPLC）

活性检测方法

平板计数法

01

通过在培养基上培养大肠杆菌，计算菌落形成单位(CFU)，以评估其活性和数量。

比浊法

02

利用分光光度计测量培养液的吸光度，间接反映大肠杆菌的浓度和活性。

酶活性测定

03

通过测定大肠杆菌产生的特定酶的活性，如β-半乳糖苷酶，来评估其生物活性。

纯化后处理

通过酶活性测定或Westernblot等方法，确保纯化后的蛋白质保持生物活性。

01

蛋白质活性检测

使用SDS或HPLC等技术评估蛋白质纯度，确保纯化效果达到实验要求。

02

纯度分析

采用特定的内毒素去除试剂或过滤方法，确保纯化后的蛋白质样品符合临床或研究使用标