第4章蛋白质一级结构测定.pptVIP

酸性磷酸酶、弹性蛋白酶也较常用第92页，共144页，星期日，2025年，2月5日分离的原理：根据肽段的物化特性，包括分子大小、电荷、极性、溶解度以及特殊的共价或非共价结合等性质。（一）肽段的分离纯化第93页，共144页，星期日，2025年，2月5日常用于检测含巯基、甲硫氨酸、赖氨酸的肽段和胰蛋白酶降解后的C端肽段。对角线法(Hartlay)两个方向上的条件相同两个方向上的条件不同，二硫键被还原第94页，共144页，星期日，2025年，2月5日检测手段分离及检测效率的提高传统层析分离技术高效液相色谱（HPLC）及质谱第95页，共144页，星期日，2025年，2月5日第五节肽段的序列测定一、手工序列测定技术（一）Edman化学降解法（二）DNS－Edman序列分析法（三）减数Edman序列分析法（四）DABITC／PITC双耦合法（五）酶学降解测定肽序列二、自动序列分析（一）液相序列仪（二）固相序列仪（三）气相序列仪第96页，共144页，星期日，2025年，2月5日异硫氰酸苯醋异硫氰酸苯酯肽2－苯胺基－5－噻唑啉酮衍生物3－苯基－2－乙内酰脲（一）Edman化学降解法第97页，共144页，星期日，2025年，2月5日（二）DNS－Edman序列分析法荧光检测，灵敏度比Edman法高几倍甚至十几倍；用酸高温水解，使Gln和Asn相应地变成Glu和Asp，而且不能检出色氨酸。第98页，共144页，星期日，2025年，2月5日（三）减数Edman序列分析法将肽链中的N端氨基酸残基逐次从肽链中除去，并随之分析相应肽链的氨基酸组成，从每一循环中氨基酸的丢失或减少，可以推出N端氨基酸的排列顺序。适用于小肽。少于10～15个残基的小肽可用本法来测定序列。第99页，共144页，星期日，2025年，2月5日（四）DABITC／PITC双耦合法DABITC是一种改进的Edman试剂（4－N,N－二甲基氨基偶氮苯－4’－异硫氰酸酯）。最后生成有明显颜色的二甲氨基偶氮苯硫氰酯氨基酸（DABTH－氨基酸）。经盐酸蒸气熏即能显示红色斑点，而杂质与试剂反应物显蓝色或紫色斑点。提高了检测的灵敏度和准确性，只要用pmol样品即可鉴定。第100页，共144页，星期日，2025年，2月5日+PITC双耦合第101页，共144页，星期日，2025年，2月5日DABITC：4－N,N－二甲胺基偶氮苯－4－异硫氰酸醋（4-N,N-dimethylaminoazobenzene-4-isothiocyanate）DABTC：4－N,N－二甲胺基偶氮苯－4－硫代氨甲酰基（4-N,N-dimethylaminoazobenzene-4-thiocarbamoyl）DABTZ：4－N，N－二甲胺基偶氮苯－4－噻唑啉酮－氨基酸（4-N,N-dimethylaminoazobenzebe-4’-thiozolinone-aa）DABTH-aa：4-N,N-二甲胺基偶氮苯-4’-乙内酰硫脲-氨基酸（4-N,N-dimethylaminoazobenzehe-4’-thiohydantoin-aa）第102页，共144页，星期日，2025年，2月5日（五）酶学降解测定肽序列1．氨肽酶法2．羧肽酶法3．外肽二肽酶测定肽序列第103页，共144页，星期日，2025年，2月5日1．氨肽酶法氨肽酶是专一性从N端逐个降解蛋白质或多肽的一类外肽酶。最常用的是亮氨酸氨肽酶（LAP）。在N端的第二个氨基酸是Pro时，则此酶不能将N端水解下来。此外，所有肽键都能被LAP水解，但水解速度变化很大、N端为极性氨基酸和芳香族氨基酸时，水解速度慢；N端为疏水侧链较大的氨基酸（如Leu）时，水解速度最快。各类氨肽酶及其专一性列于下表中。第104页，共144页，星期日，2025年，2月5日2．羧肽酶法常用的羧肽酶有三类：A、B、C。其中羧肽酶A最为常用。但用它也只能确定4～5个氨基酸残基序列。第105页，共144页，星期日，2025年，2月5日该反应依赖pH，并需过量Dansyl－Cl试剂。His的咪唑基、Cys的巯基、Tyr的酚基和Lys的ε－氨基等也能和试剂反应，生成相应的衍生物，但这些物质不影响N