8、实验八 菠菜中色素的提取与分离.docxVIP

实验八菠菜色素的提取和色素的分离

一、实验目的

1.通过菠菜色素的提取和分离，了解天然物质的分离提纯方法。

2.通过柱色谱和薄层色谱分离操作，深入了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。

3.通过植物色素的提取与分离，加深对天然色素有关知识的理解。

二、实验原理

绿色植物（如菠菜）叶中含有叶绿素（绿色）、胡萝卜素（橙色）和叶黄素（黄色）等多种天然色素。

叶绿素存在两种结构相似的形式，即叶绿素a（C55H72O5N4Mg）和叶绿素b（C55H70O6N4Mg），其差别仅是叶绿素a中一个甲基被甲酰基所取代从而形成了叶绿素b。它们都是吡咯衍生物与金属镁的配合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a的含量通常是叶绿素b的3倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。

胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素，其中β-胡萝卜素含量最多，也最重要。在生物体内，β-胡萝卜素受酶催化氧化形成维生素A。目前β-胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素A使用，也可作为食品工业中的色素。

叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。

本实验从菠菜中提取上述几种色素，并通过薄层层析和柱层析进行分离。

三、仪器与试剂

1.仪器：研钵，布氏漏斗，分液漏斗，圆底烧瓶，直形冷凝管，层析缸，层析柱等。

2.试剂：硅胶G，中性氧化铝，甲醇，石油醚（60～90℃），丙酮，乙酸乙酯，菠菜叶等。

四、实验步骤

（一）菠菜色素的提取

称取30g洗净后的新鲜（或冷冻）的菠菜叶，用剪刀剪碎并与30mL甲醇拌匀，在研钵中研磨约5min，然后用布氏漏斗抽滤菠菜汁，弃去滤渣。

将菠菜汁放回研钵，用3∶2（体积比）的石油醚-甲醇混合液萃取两次，每次30mL，每次须加以研磨并且抽滤。合并深绿色萃取液，转入分液漏斗，用水洗涤两次，每次5mL，以除去萃取液中的甲醇。洗涤时要轻轻旋荡，以防止产生乳化。弃去水-甲醇层，石油醚层用无水硫酸钠干燥后滤入圆底烧瓶，在水浴上蒸去大部分石油醚，至体积约为1mL为止。

（二）薄层层析

取四块显微载玻片，用硅胶G加0.5%羧甲基纤维素调制后制板，晾干后在110℃活化1h。

展开剂：（a）石油醚-丙酮（体积比为8∶2）；

（b）石油醚-乙酸乙酯（体积比为6∶4）。

取活化后的层析板，点样后，小心放入预先加入选定展开剂的层析缸内，盖好瓶盖。待展开剂上升至规定高度时，取出层析板，在空气中晾干，用铅笔做出标记，并计算出Rf值。

分别用展开剂a和b展开，比较不同展开剂系统的展开效果。观察斑点在板上的位置并排列出胡萝卜素、叶绿素和叶黄素的Rf值的大小次序。注意更换展开剂时，须干燥层析缸。

（三）柱层析

在层析柱中，加3cm高的石油醚。另取少量脱脂棉，先在小烧杯中用石油醚浸湿，挤压以驱除气泡，然后放在层析柱底部，轻轻压紧，塞住底部。将3g层析用的中性氧化铝（150～160目），从玻璃漏斗中缓缓加入，小心打开柱下活塞，保持石油醚高度不变，流下的氧化铝在柱子中堆积。必要时用橡皮锤轻轻在层析柱的周围敲击，使吸附剂填装得均匀致密。柱中溶剂面由下端活塞控制，既不能满溢，更不能干涸。装完后，上面再加一片圆形滤纸，打开下端活塞，放出溶剂，直到氧化铝表面溶剂剩下1～2mm高时关上活塞（注意！在任何情况下，氧化铝表面不得露出液面）。

将上述菠菜色素的浓缩液用滴管小心地加到层析柱顶部，加完后，打开下端活塞，让液面下降到柱面以上1mm左右，关闭活塞，加数滴石油醚，打开活塞，使液面下降，经几次反复，使色素全部进入柱体。

待色素全部进入柱体后，在柱顶小心加洗脱剂———石油醚-丙酮溶液（体积比为9∶1）。打开活塞，让洗脱剂逐滴放出，层析即开始进行，用锥形瓶收集。当第一个有色成分即将滴出时，取另一锥形瓶收集，得橙黄色溶液，它就是胡萝卜素。

用石油醚-丙酮（体积比为7∶3）作洗脱剂，分出第二个黄色带，它是叶黄素。再用丁醇-乙醇-水（体积比为3∶1∶1）洗脱叶绿素a（蓝绿色）和叶绿素b（黄绿色）。

五、注意事项

叶黄素易溶于醇而在石油醚中溶解度较小，从嫩绿菠菜得到的提取液中，叶黄素含量很少，柱色谱中不易分出黄色带。

六、思考题

1.为什么必须保证所装柱中没有空气泡？

2.柱色谱所选择的洗脱剂为什么要先用非极性或弱极性的，然后使用较强极性的洗脱剂洗脱？