目的基因导入受体细胞.pptVIP

接合型质粒分子较大，自我转移的随意性强，转移过程中经常伴随着宿主细胞染色体的高频转移，因此难以作为基因工程载体使用。目前常用的质粒载体多是在非接合型质粒或缺失了接合转移基因的接合型质粒的基础上构建的，故重组质粒DNA分子也不能直接接进行接合转化．而只能通过其迁移作用来完成。第31页，共75页，星期日，2025年，2月5日首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。整个接合转化过程涉及到3种有关的细菌菌株，即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒DNA的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，因此称为三亲本杂交接合转化法。第32页，共75页，星期日，2025年，2月5日第33页，共75页，星期日，2025年，2月5日（4）转化率的计算及其影响因素转化率是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率，有两种表示方式：一是以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示；二是以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示。用每单位质量的DNA分子获得的转化子数来表示，难以反映分子大小与转化率之间的关系。第34页，共75页，星期日，2025年，2月5日以用于转化处理的受体细胞数为基数来计算转化率，首先必须通过菌液OD值测定或细菌计数，计算出用于制备感受态细胞的受体菌总数。然后计算转化子与受体菌的比率。第35页，共75页，星期日，2025年，2月5日影响转化率的因素分子质量较小的重组质粒DNA分子转化率较高，分子质量较大的重组质粒DNA分子转化率较低，对于大于30kb的重组质粒则很难进行转化。组成重组DNA分子的载体类型及其构型。与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体，而处于自然双螺旋闭环结构的质粒载体比开环结构成线性结构的质粒载体有更高的转化率。经体外酶切、酶连操作后的载体DNA或重组DNA分子由于空间构象难以恢复，转化率一般要比具有超螺旋结构的质粒低两个数量级。重组DNA分子的浓度和纯度。在10ng／100u1以下的DNA浓度范围内，转化效率与DNA分子数成正比关系。第36页，共75页，星期日，2025年，2月5日同一重组质粒DNA分子转化不同的受体菌细胞，转化率不同——受体细胞的选择对于重组DNA分子的转化也是极为重要。前述三种转化方法中，最佳转化率以电穿孔法最高（108~1010）；Ca2+诱导转化法居中（107~108）；而三亲本杂交转移法最低（104~105），但它适于前两种方法难以转化的受体菌。第37页，共75页，星期日，2025年，2月5日在转化操作方而，受体细胞的预处理或感受态细胞的制备对转化率影响最大。如Ca2+诱导大肠杆菌转化法，菌龄、Cacl2处理时间、感受态细胞的保存期以及热激时间均是重要的影响因素。电穿孔转化法中，对受体细胞进行冰冻甘油预处理后的转化率，要比不经此预处理的转化率高10~100倍。第38页，共75页，星期日，2025年，2月5日5.2.2重组λ噬菌体DNA分子转导大肠杆菌将重组λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程，称为转染。将重组λ噬菌体DNA分子导入大肠杆菌受体细胞的常规方法是转导操作。转导(transduction)是指通过λ噬菌体(病毒)颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。第39页，共75页，星期日，2025年，2月5日具有感染能力的λ噬菌体颗粒除含有λ噬菌体DNA分子外，还包括外被蛋白。以噬菌体颗粒感染受体细胞，首先必须对重组A噬菌体DNA分子进行体外包装。体外包装，是指在体外模拟λ噬菌体DNA分子在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反应过程，将重组λ噬菌体DNA分子包装为成熟的具有感染能力的λ噬菌体颗粒的技术。第40页，共75页，星期日，2025年，2月5日基本原理，根据λ噬菌体DNA体内包装的途径，分别获得缺失D包装蛋白的λ噬菌体突变株和缺失E包装蛋白的λ噬菌体突变株。这两种突变株均不能单独地包装λ噬菌体DNA，但将它们分别感染大肠杆菌，从中提取缺失D蛋白的包装物（含E蛋白)和缺失E蛋白的包装物(含D蛋白)，两者混合后就能包装λ噬菌体DNA。第41页，共75页，星期日，2025年，2月5日λ噬菌体DNA体外包装的主要过程①制备包装物。首先，须培养两种溶原菌第二，诱导溶菌生长第三，收集和贮存包装物。②体外包装。制备λ噬菌体DNA混合液。第一次包装。包装物刚融化时，细胞发生破裂，释放出包装物可立即用于包装。第二次包装。进行第二次包装，可提高包装效率2－5倍，加入蛋白酶可降低包装反应液的黏度，便于包装